Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди
Çàìîðàæèâàíèå
-
îòòàèâàíèå.
Àãàðîçíûé
ãåëü ñ ÄÍÊ 10
ìèí
èíêóáèðîâàëè
â æèäêîì
àçîòå è
îñàæäàëè
öåíòðèôóãèðîâàíèåì
ïðè 12000 g â
òå÷åíèå 15
ìèí, ïîñëå
÷åãî äîáàâëÿëè
ê
ñóïåðíàòàíòó
1/10 îáúåìà 3 Ì NaAc, 2
îáúåìà ýòàíîëà
è îñàæäàëè
ÄÍÊ ïðè 12000 g â
òå÷åíèå 10
ìèí.
ÏÎËÓ×ÅÍÈÅ
ÐÀÄÈÎÀÊÒÈÂÍÛÕ
ÇÎÍÄÎÂ
500
íã
ÄÍÊ-ìàòðèöû
è 100 íã
ïðàéìåðà
äåíàòóðèðîâàëè
â 10 ìêë âîäû
ïðè 100îÑ â
òå÷åíèå 10
ìèí è áûñòðî
îõëàæäàëè äî
0îÑ. Çàòåì
äîáàâëÿëè 10
ìêë
10-êðàòíîãî
áóôåðà (40 ìÌ KP04
ðÍ 7,5, 6,6 ìÌ MgCl2 è 1,0
ìÌ
2-ìåðêàïòîýòàíîë),
0,1-0,5 ìÊè 32Ð-dATÔ, 10
ìêë 2 ìÌ
ðàñòâîðà
òðåõ äðóãèõ
íåìå÷åíûõ
äÍTÔ äî
êîíöåíòðàöèè
200 ìêÌ. Îáúåì
ðåàêöèîííîé
ñìåñè
äîâîäèëè
âîäîé äî 100 ìêë,
äîáàâëÿëè 3
ìêë
ôðàãìåíòà
Êëåíîâà
ÄÍÊ-ïîëèìåðàçû
I (10-12 å.à.) è
èíêóáèðîâàëè
ïðè
êîìíàòíîé
òåìïåðàòóðå
â òå÷åíèå 30 ìèí.
Î÷èñòêó
çîíäà
ïðîâîäèëè
ìåòîäîì ãåëü
- ôèëüòðàöèè
íà êîëîíêå ñ
áèîãåëåì Ï-10
(Ìàíèàòèñ è
äð., 1984).
ÂÛÄÅËÅÍÈÅ
ÏËÀÇÌÈÄÍÎÉ
ÄÍÊ
Êëåòêè
Escherichia coli,
âûðàùåííûå
â ñðåäå
Ëóðèà-Áåðòàíè
(1% NaCl, 1% áàêòî-òðèïòîí,
0,5%
áàêòî-äðîææåâîé
ýêñòðàêò, ðÍ 7,5)
(ñðåäà LB) ñ
àìïèöèëëèíîì
(50 ìêã/ìë),
îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì
ïðè 4000 g. Çàòåì
îñàäîê ñóñïåíäèðîâàëè
â áóôåðå STET (8%
ñàõàðîçà, 0,5%
òðèòîí X-100, 10 ìÌ
òðèñ-HCl è 50 ìÌ Na2ÝÄÒÀ,
ðÍ 8,0) è
äîáàâëÿëè ëèçîöèì
äî
êîíöåíòðàöèè
0,8 ã/ìë. Ñìåñü
èíêóáèðîâàëè
ïðè
êîìíàòíîé
òåìïåðàòóðå
â òå÷åíèå 5
ìèí è ïðè 100îÑ
â òå÷åíèå 1
ìèí. Ïîñëå
ýòîãî
êëåòî÷íûé
äåáðèñ
îñàæäàëè
öåíòðèôóãèðîâàíèåì
ïðè 16000 g â
òå÷åíèå 15
ìèí.
Äëÿ
îñàæäåíèÿ
ïëàçìèäíîé
ÄÍÊ ê
ñóïåðíàòàíòó
äîáàâëÿëè 1/10
îáúåìà 3 Ì
ðàñòâîðà
àöåòàòà
íàòðèÿ,
ðàâíûé
îáúåì
èçîïðîïàíîëà
è öåíòðèôóãèðîâàëè
ïðè 16000 g â
òå÷åíèå 15
ìèí ïðè 20îÑ.
Çàòåì
ïðîìûâàëè
îñàäîê
äîáàâëåíèåì
80% ýòàíîëà è
ïîâòîðíûì
öåíòðèôóãèðîâàíèåì
â òå÷åíèå 5
ìèí ïðè 20îÑ
(Ìàíèàòèñ è
äð., 1984).
Î×ÈÑÒÊÀ
ÏËÀÇÌÈÄÍÎÉ
ÄÍÊ ÌÅÒÎÄÎÌ
ÐÀÂÍÎÂÅÑÍÎÃÎ
ÖÅÍÒÐÈÔÓÃÈÐÎÂÀÍÈß
 ÃÐÀÄÈÅÍÒÅ
ÏËÎÒÍÎÑÒÈ CsCl
Íà
êàæäûå 10 ìë
ðàñòâîðà
ïëàçìèäíîé
ÄÍÊ, ïîëó÷åííîãî
ïîñëå
îñàæäåíèÿ
ëèçèðîâàííûõ
êëåòîê (ñì.
Âûäåëåíèå
ïëàçìèäíîé
ÄÍÊ), äîáàâëÿëè
1 ã ñóõîãî CsCl,
ñîëü
ðàñòâîðÿëè,
ïîñëå ÷åãî
íà êàæäûå 10 ìë
ðàñòâîðà
äîáàâëÿëè 0,8
ìë ðàñòâîðà
áðîìèñòîãî
ýòèäèÿ ñ
êîíöåíòðàöèåé
10 ìã/ìë. Ñìåñü
ïîìåùàëè â
öåíòðèôóæíûå
ïðîáèðêè Beckman,
çàïîëíÿëè
äîâåðõó
ðàñòâîðîì CsCl è
áðîìèñòîãî
ýòèäèÿ òîé
æå
ïëîòíîñòè è
öåíòðèôóãèðîâàëè
â ðîòîðå Ti 60 ïðè 45000
îá/ìèí è
òåìïåðàòóðå
20îÑ â
òå÷åíèå 36
÷àñîâ. Ïîñëå
ýòîãî
îòáèðàëè êîëüöåâóþ
êîâàëåíòíî
çàìêíóòóþ
ïëàçìèäíóþ
ÄÍÊ è
ýêñòðàãèðîâàëè
áðîìèñòûé
ýòèäèé èç
ðàñòâîðà äî
ïîëíîãî
îáåñöâå÷èâàíèÿ
ðàâíûì
îáúåìîì
í-áóòàíîëà,
ïðåäâàðèòåëüíî
íàñûùåííîãî
1 Ì ðàñòâîðîì
NaCl.
ÄÍÊ
îñàæäàëè
öåíòðèôóãèðîâàíèåì
ïðè 15000 g, äîáàâèâ
ðàâíûé
îáúåì 1 Ì
ðàñòâîðà NH4Cl
è äâà îáúåìà
ýòàíîëà.
Ïîñëå
ïðîìûâàíèÿ ýòàíîëîì
îñàäîê ÄÍÊ
ðàñòâîðÿëè â
âîäå äî êîíöåíòðàöèè
1 ìêã/ìêë
(Ìàíèàòèñ è
äð., 1984).
ÒÐÀÍÑÔÎÐÌÀÖÈß
ÏÐÎÊÀÐÈÎÒÈ×ÅÑÊÈÕ
ÊËÅÒÎÊ
Õèìè÷åñêàÿ
òðàíñôîðìàöèÿ.
Äëÿ
ïîäãîòîâêè
êîìïåòåíòíûõ
êëåòîê E.coli
øòàìì XL-1 Blue MRF ' è
âûðàùèâàëè
â 100 ìë
2-êðàòíîé
ñðåäû Ëóðèà (2%
áàêòî-òðèïòîí,
1%
áàêòî-äðîææåâîé
ýêñòðàêò, 0,1% NaCl, 0,4%
ãëþêîçà, ðÍ 7,0)
ïðè 37îÑ äî
îïòè÷åñêîé
ïëîòíîñòè D550=0,35.
Êëåòî÷íóþ
ñóñïåíçèþ
âûäåðæèâàëè
ïðè 0îÑ â
òå÷åíèå 2
÷àñîâ. Çàòåì
êëåòêè
îñàæäàëè
öåíòðèôóãèðîâàíèåì
ïðè 4000 g,
òåìïåðàòóðå 4îÑ
è
ñóñïåíäèðîâàëè
â 50 ìë
ëåäÿíîãî
áóôåðà À (100 ìÌ CaCl2,
70 ìÌ MnCl2, 40 ìÌ NaAc, ðÍ
5,5). Ïîñëå ýòîãî
ñóñïåíçèþ
êëåòîê
âûäåðæèâàëè
ïðè 0îÑ â
òå÷åíèå 30
ìèí, ïîñëå
÷åãî êëåòêè
îñàæäàëè è
ñóñïåíäèðîâàëè
â 5 ìë áóôåðà À
ñ 15% ãëèöåðèíà.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17
|
|