Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди 
Äëÿ
òðàíñôîðìàöèè
ê 200 ìêë
ñóñïåíçèè
êîìïåòåíòíûõ
êëåòîê
äîáàâëÿëè 30
íã
ïëàçìèäíîé
ÄÍÊ,
ðàñòâîðåííîé
â 100 ìêë âîäû è
âûäåðæèâàëè
ïðè 0îÑ â
òå÷åíèå 30
ìèí. Çàòåì
èíêóáèðîâàëè
ïðè 37îÑ â
òå÷åíèå 5
ìèí, ïîñëå
÷åãî
äîáàâëÿëè 3 ìë
ñðåäû LB è
èíêóáèðîâàëè
ïðè 37îÑ åùå 90
ìèí. Êëåòêè
ñîáèðàëè
öåíòðèôóãèðîâàíèåì
è âûñåâàëè
íà
ñåëåêòèâíóþ
ñðåäó (Ìàçèí
è äð., 1988).
Ýëåêòðîòðàíñôîðìàöèÿ.
Äëÿ
ïîäãîòîâêè
êîìïåòåíòíûõ
êëåòîê E.coli
øòàìì XL-1 Blue MRF '
âûðàùèâàëè
â 100 ìë ñðåäû LB
(ñì. Õèìè÷åñêàÿ
òðàíñôîðìàöèÿ)
ïðè
êîìíàòíîé
òåìïåðàòóðå
äî
îïòè÷åñêîé
ïëîòíîñòè D550=0,45.
Çàòåì
êëåòêè
îñàæäàëè
öåíòðèôóãèðîâàíèåì
ïðè 4000 g, 4îÑ è
ïðîìûâàëè
ñóñïåíäèðîâàíèåì
ïîñëåäîâàòåëüíî
â 100 ìë, 50 ìë è 10ìë 10%
ðàñòâîðà
ãëèöåðèíà ïðè
0-4îÑ. Ïîñëå
ýòîãî
êëåòêè
ñóñïåíäèðîâàëè
â 240 ìêë
ëåäÿíîãî
ðàñòâîðà GYT (10%
ãëèöåðèí, 0,125%
áàêòî-äðîææåâîé
ýêñòðàêò, 0,25%
áàêòî-òðèïòîí).
Äëÿ
òðàíñôîðìàöèè
ê 40 ìêë
ñóñïåíçèè
êîìïåòåíòíûõ
êëåòîê äîáàâëÿëè
1 ìêë ÄÍÊ
âåêòîðà (50 íã)
ïðè 0-4îÑ è
ïðîïóñêàëè
ýëåêòðè÷åñêèé
ðàçðÿä (U=18000 Â). Çàòåì
äîáàâëÿëè 1 ìë
SOC (2%
áàêòî-òðèïòîí,
0,5% áàêòî-äðîææåâîé
ýêñòðàêò, 10
ìÌ NaCl, 2,5 ìÌ KCl, 10 ìÌ MgCl2,
10 ìÌ MgSO4, 20 ìÌ
ãëþêîçà),
ïåðåìåøèâàëè,
ïåðåíîñèëè â
3 ìë ñðåäû SOC,
ïðîãðåòîé äî 42îÑ,
è
èíêóáèðîâàëè
ïðè 37îÑ â
òå÷åíèå 1
÷àñà (Wai Lin Tung and King-C. Chow, 1995).
ÂÛÄÅËÅÍÈÅ
ËÅÉÊÎÖÈÒÎÂ
ÈÇ ÊÐÎÂÈ ÐÛÁ
Êðîâü
ñîáèðàëè íà
õîëîäó ÷åðåç
êàóäàëüíóþ
àðòåðèþ ñ
äîáàâëåíèåì
íà êàæäûå 5 ìë
êðîâè 1 ìë 2,7%
ðàñòâîðà Na2ÝÄÒÀ,
ðÍ 7,4. Ê
âûäåëåííîé
êðîâè
äîáàâëÿëè
ðàâíûé
îáúåì
òðèñ-ñîëåâîãî
áóôåðà (TBS) (0,14 Ì NaCl, 5
ìÌ KCl, 25 ìÌ òðèñ-HCl,
ðÍ 7,4). Ñìåñü
íàíîñèëè
ïðè
êîìíàòíîé
òåìïåðàòóðå
íà ðàâíûé
îáúåì ñðåäû
äëÿ âûäåëåíèÿ
ëåéêîöèòîâ,
ñîäåðæàùåé 24
÷àñòè 9% ôèêîëà
è 10 ÷àñòåé 34%
âåðîãðàôèíà.
Ïîñëå öåíòðèôóãèðîâàíèÿ
ïðè 400 g â
òå÷åíèå 30
ìèí îòáèðàëè
ñëîé
ëåéêîöèòîâ
è ðàçâîäèëè
â áîëüøîì îáúåìå
áóôåðà TBS.
Ïîñëå
ïîâòîðíîãî
öåíòðèôóãèðîâàíèÿ
ïðè 300 g â
òå÷åíèå 40
ìèí äëÿ
ëèçèñà
îñòàòî÷íûõ
ýðèòðîöèòîâ
êëåòêè
ñóñïåíäèðîâàëè
â ðàñòâîðå,
ñîäåðæàùåì 9
îáúåìîâ 0,83% ðàñòâîðà
NH4Cl è 1 îáúåì 2,06%
ðàñòâîðà
òðèñ-HCl, ðÍ 7,62, äî
êîíöåíòðàöèè
108 êë/ìë è
äîáàâëÿëè 5
îáúåìîâ
ñðåäû. Ïîñëå
îñàæäåíèÿ
êëåòîê ïðè 300 g â
òå÷åíèå 10
ìèí ïðîöåäóðó
î÷èñòêè
ïîâòîðèëè
(Ôðèìåëü, 1987).
ÂÛÄÅËÅÍÈÅ
ÑÓÌÌÀÐÍÎÉ
ÐÍÊ ÈÇ
ËÅÉÊÎÖÈÒÎÂ
Îñàäîê
ëåéêîöèòîâ
ïîñëå
âûäåëåíèÿ è
î÷èñòêè
ñóñïåíäèðîâàëè
â 10 îáúåìàõ (1
ìë) ðàñòâîðà 1,
ñîäåðæàùåãî
4 Ì ãóàíèäèí
òèîöèàíàò, 25
ìÌ öèòðàò
íàòðèÿ, ðÍ 7,0, 0,5%
ñàðêîçèë è 0,1 Ì
2-ìåðêàïòîýòàíîë,
ïðè
êîìíàòíîé
òåìïåðàòóðå.
Çàòåì
äîáàâëÿëè 0,1
ìë 2 Ì
ðàñòâîðà NaAc, ðÍ
4,0, 1 ìë ôåíîëà, 0,2
ìë
õëîðîôîðìà è
ïåðåìåøèâàëè.
Çàòåì
öåíòðèôóãèðîâàëè
ïðè 10000 g â
òå÷åíèå 20 ìèí
ïðè 4îÑ,
îòáèðàëè
âîäíóþ ôàçó,
äîáàâëÿëè ê
íåé ðàâíûé
îáúåì
èçîïðîïàíîëà
è îñàæäàëè
ÐÍÊ öåíòðèôóãèðîâàíèåì
ïðè 15000 g â
òå÷åíèå 15
ìèí ïðè 4îÑ
(Chomczynski and Sacchi, 1987).
ÂÛÄÅËÅÍÈÅ
ÂÛÑÎÊÎÌÎËÅÊÓËßÐÍÎÉ
ÄÍÊ ÈÇ ÝÓÊÀÐÈÎÒÈ×ÅÑÊÈÕ
ÊËÅÒÎÊ
1
ã ïå÷åíè
ñòåðëÿäè,
çàìîðîæåííîé
â æèäêîì àçîòå,
ðàñòèðàëè â
òîíêèé
ïîðîøîê è
ãîìîãåíèçèðîâàëè
â 15 ìë
ðàñòâîðà,
ñîäåðæàùåãî
0,5 Ì Na2ÝÄÒÀ, ðÍ 8,0,
0,5% ñàðêîçèëà, 100
ìêã/ìë
ïðîòåèíàçû
Ê è
íàãðåòîãî
äî 65îÑ.
Çàòåì
èíêóáèðîâàëè
ïðè 50îÑ
òå÷åíèå 3
÷àñîâ ïðè
ëåãêîì
ïîêà÷èâàíèè.
Çàòåì,
èçáåãàÿ
ðåçêèõ
âñòðÿõèâàíèé,
ýêñòðàãèðîâàëè
ÄÍÊ ðàâíûì
îáúåìîì
ôåíîëà òðè
ðàçà, êàæäûé
ðàç ðàçäåëÿÿ
ôðàêöèè
öåíòðèôóãèðîâàíèåì
ïðè 4000 g è
êîìíàòíîé
òåìïåðàòóðå.
Ôåíîë
ïðåäâàðèòåëüíî
î÷èùàëè
ïåðåãîíêîé è
íàñûùàëè
áóôåðîì,
ñîäåðæàùèì 1
Ì òðèñ-HCl, îäèí
ðàç è äâà
ðàçà
áóôåðîì,
ñîäåðæàùèì 0,1
Ì òðèñ-HCl è 0,1%
2-ìåðêàïòîýòàíîë.
Äèàëèç ÄÍÊ
ïðîâîäèëè ïðè
10îÑ â
òå÷åíèå 12
÷àñîâ
ïðîòèâ 4 ë
áóôåðà,
èìåþùåãî
ñîñòàâ:
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17
|
|
