Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

    ïðàìåð Ò3

5'-GCAATTAACCCTCACTAAAGG-3';

    J-ïðàéìåð

5'-A(G/C)(T/C)(T/C)TGGT(T/G/C)CCTTTTCC(A/G)AA-3’

          Ðèñ. 10. Ñõåìà ÏÖÐ. Ò3 ïðàéìåð ðàñïîëàãàåòñÿ âáëèçè ñàéòà êëîíèðîâàíèÿ ìîëåêóëû êÄÍÊ è êîìïëèìåíòàðåí íåêîäèðóþùåé öåïè, J-ïðàéìåð ãîìîëîãè÷åí ó÷àñòêó êîäèðóþùåé öåïè J-ñåãìåíòà ãåíîâ L-öåïåé Èà ïîçâîíî÷íûõ. Îæèäàåìàÿ äëèíà ïðîäóêòîâ îêîëî 400 ïí.

            ÎÏÐÅÄÅËÅÍÈÅ ÏÅÐÂÈ×ÍÎÉ ÑÒÐÓÊÒÓÐÛ

          Îïðåäåëåíà íóêëåîòèäíàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü âñòàâêè êÄÍÊ êëîíà Â1. êÄÍÊ êëîíà Â1 ðàçìåðîì 1050 ïí ïðåäñòàâëÿëà ñîáîé ïîëíîðàçìåðíóþ êîïèþ çðåëîãî ãåíà L-öåïè Èà è ñîäåðæàëà 5’-íåòðàíñëèðóåìóþ îáëàñòü, ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êîäèðóþùóþ ëèäåðíûé ïåïòèä, V îáëàñòü, Ñ îáëàñòü, à òàêæå  3’-íåòðàíñëèðóåìóþ îáëàñòü (Ðèñ. 11). Íà îñíîâå ïåðâè÷íîé ñòðóêòóðû êëîíà Â1 ñêîíñòðóèðîâàëè è ñèíòåçèðîâàëè òðè ïðàéìåðà, ñîîòâåòñòâóþùèõ êîíñåðâàòèâíûì ðàéîíàì V è C îáëàñòè è èñïîëüçîâàëè èõ äëÿ îïðåäåëåíèÿ íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè êëîíîâ Å4 è Ñ2. Ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êëîíà Å4 áûëà îïðåäåëåíà òîëüêî â îáëàñòè, ïðèìûêàþùåé ê Ò3 ïðîìîòîðó âåêòîðà. Çà èñêëþ÷åíèåì 2 íóêëåîòèäîâ îíà ïîëíîñòüþ èäåíòè÷íà ïîñëåäîâàòåëüíîñòè Â1. Ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êëîíà Ñ2 èìåëà õèìåðíûé õàðàêòåð.  îáëàñòè Ò3 ïðîìîòîðà îíà ñîäåðæàëà ôðàãìåíò ñîîòâåòñòâóþùèé 3’ ÷àñòè Ñ ñåãìåíòà êëîíà B1 ñ çàìåíàìè íåñêîëüêèõ íóêëåîòèäîâ.  òî æå âðåìÿ èñïîëüçîâàíèå äëÿ îïðåäåëåíèÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ïðàéìåðîâ V è C îáëàñòè ïîêàçàëî, ÷òî ýòà âñòàâêà ñîäåðæèò äîïîëíèòåëüíî ïåðåñòðîåííûé ãåí ëåãêîé öåïè, ñîäåðæàùèé áîëüøóþ ÷àñòü V ñåãìåíòà è âòîðîé Ñ ñåãìåíò, îòëè÷àþùèéñÿ îò ïåðâîãî â îäíîé ïîçèöèè. Ïîñêîëüêó ïîêà íå óäàëîñü îïðåäåëèòü ïîñëåäîâàòåëüíîñòü â îáëàñòè ñòûêà ýòèõ äâóõ ôðàãìåíòîâ âñòàâêè, íåëüçÿ ñêàçàòü, íàõîäÿòñÿ ëè îíè â îäíîé èëè ðàçíûõ îðèåíòàöèÿõ. Ïî-âèäèìîìó, ñõîäíûé õèìåðíûé õàðàêòåð èìååò ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êëîíà D2 (äàííûå íå ïîêàçàíû).

            ÑÐÀÂÍÈÒÅËÜÍÛÉ ÀÍÀËÈÇ ÏÅÐÂÈ×ÍÎÉ ÑÒÐÓÊÒÓÐÛ

          Íóêëåîòèäíóþ è ïðåäñêàçàííûå àìèíîêèñëîòíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè êëîíà Â1 ñðàâíèâàëè ñ ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿìè V è C ãåíîâ L-öåïåé Èà äðóãèõ âèäîâ ïîçâîíî÷íûõ (Ðèñ 12). Íà àìèíîêèñëîòíîì óðîâíå V îáëàñòü èìååò íàèáîëüøåå ñõîäñòâî ñ V-îáëàñòÿìè L-öåïåé êëàññà F è G ïåùåðíîãî ñîìèêà è ñ V-îáëàñòüþ L1 êëàññà Èà ôîðåëè (63-71%). È òå è äðóãèå îòíîñÿòñÿ ê êàïïà-òèïó  L-öåïåé. Ïðè ïîèñêå ãîìîëîãîâ â ïîëíîì áàíêå ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé Èà ìëåêîïèòàþùèõ ïåðâûå 100 ïîçèöèé ñ íàèáîëüøèì ñõîäñòâîì ïðåäñòàâëÿëè ñîáîé òàêæå V êàïïà îáëàñòè.

          Ñ-îáëàñòü êëîíà Â1 èìååò íà àìèíîêèñëîòíîì óðîâíå ïðèáëèçèòåëüíî îäèíàêîâîå è íå î÷åíü çíà÷èòåëüíîå ñõîäñòâî ñ øèðîêèì ñïåêòðîì Ñ-îáëàñòåé L-öåïåé Èà õðÿùåâûõ è êîñòèñòûõ ðûá (41-44%). Íà íóêëåîòèäíîì óðîâíå íàèáîëåå áëèçêèìè ãîìîëîãàìè Â1Ñ ãåíà ÿâëÿþòñÿ ãåíû III êëàññà õðÿùåâûõ ðûá (65%).

            ÀÍÀËÈÇ ÃÅÍÎÌÍÎÉ ÎÐÃÀÍÈÇÀÖÈÈ

          Ãåíîìíóþ îðãàíèçàöèþ ëîêóñà ãåíîâ L-öåïåé Èà ñòåðëÿäè îöåíèâàëè ìåòîäîì Ñàóçåðí áëîò ãèáðèäèçàöèè. Ãåíîìíóþ ÄÍÊ âûäåëÿëè èç ïå÷åíè ñòåðëÿäè. ÄÍÊ ðàñùåïëÿëè ýíäîíóêëåàçàìè ðåñòðèêöèè Pst I è Pvu II. Ïîñëå ýëåêòðîôîðåòè÷åñêîãî ðàçäåëåíèÿ è ïåðåíîñà ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ íà íèòðîöåëëþëîçíóþ ìåìáðàíó ïðîâîäèëè ãèáðèäèçàöèþ â ìÿãêèõ óñëîâèÿõ.  êà÷åñòâå çîíäà íà V-ãåíû èñïîëüçîâàëè ôðàãìåíò, ïîëó÷åííûé â ðåçóëüòàòå ÏÖÐ (ñì. Êîíñòðóèðîâàíèå áèáëèîòåêè êÄÍÊ è åå ñêðèíèíã).  êà÷åñòâå Ñ-çîíäà èñïîëüçîâàëè ó÷àñòîê êÄÍÊ êëîíà Â1, êîäèðóþùèé CL ñåãìåíò, êîòîðûé âûðåçàëè ïî ñàéòàì ðåñòðèêöèè ýíäîíóêëåàçàìè EcoR V-Xho I.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17