Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди 
6% àêðèëàìèä,
8 Ì ìî÷åâèíà,
1-êðàòíûé
ãëèöåðèí-òîëåðàíòíûé
áóôåð (1,1% òðèñ, 0,36%
òàóðèí, 0,02% Na2ÝÄÒÀ).
Ýëåêòðîôîðåç
ïðîâîäèëè
ïðè
íàïðÿæåíèè 40
Â/ñì. Çàòåì
ãåëü
âûäåðæèâàëè 30
ìèí â 10%
óêñêñíîé
êèñëîòå,
âûñóøèâàëè
è
ýêñïîíèðîâàëè
12 ÷àñîâ ïðè
êîìíàòíîé
òåìïåðàòóðå
ñ ðåíòãåíîâñêîé
ïëåíêîé
(Ìàíèàòèñ è
äð., 1984).
ÑÀÓÇÅÐÍ
ÁËÎÒ
ÃÈÁÐÈÄÈÇÀÖÈß
10
ìêã
ãåíîìíîé
ÄÍÊ,
âûäåëåííîé
èç ïå÷åíè ñòåðëÿäè,
èíêóáèðîâàëè
â òå÷åíèå 2
÷àñîâ ñ ýíäîíóêëåàçàìè
ðåñòðèêöèè Pst
I è Pvu II (ïî 50 å.à.)
ïðè 37îÑ â
áóôåðå,
ñîäåðæàùåì 100
ìÌ NaCl, 10 ìÌ òðèñ-HCl,
ðÍ 7,5, 10 ìÌ MgCl2, 100
ìêã/ìë áû÷èé
ñûâîðîòî÷íûé
àëüáóìèí, 6
ìÌ 2-ìåðêàïòîýòàíîë.
Çàòåì
ýêñòðàãèðîâàëè
ÄÍÊ
ïîñëåäîâàòåëüíî
ðàâíûìè
îáúåìàìè ôåíîë-õëîðîôîðìà
(1:1) è
õëîðîôîðìà,
îñàæäàëè ÄÍÊ
äâóìÿ
îáúåìàìè
ýòàíîëà,
ðàñòâîðÿëè â
âîäå è
íàíîñèëè íà
1% àãàðîçíûé
ãåëü. Ýëåêòðîôîðåç
ïðîâîäèëè
ïðè
íàïðÿæåíèè 1
Â/ñì è òåìïåðàòóðå
12îÑ â
òå÷åíèå 12
÷àñîâ. Çàòåì
ãåëü
èíêóáèðîâàëè
ïðè
êîìíàòíîé
òåìïåðàòóðå
30 ìèí â 0,25 Ì HCl, 30
ìèí â
äåíàòóðèðóþùåì
ðàñòâîðå (0,5 Ì NaOH, 1,5
M NaCl) è 10-15 ìèí â
ðàñòâîðå 1 (0,25 Ì NaOH,
1,5 M NaCl). Ïîñëå
ýòîãî ÄÍÊ
ïåðåíîñèëè
íà
íåéëîíîâóþ
ìåìáðàíó
ìåòîäîì âàêóóìíîãî
ïåðåíîñà â
ðàñòâîðå 1.
Ìåìáðàíó ñïîëàñêèâàëè
â 2-êðàòíîì SSC,
âûñóøèâàëè
è ôèêñèðîâàëè
ÄÍÊ â
òå÷åíèå 10
ìèí
óëüòðàôèîëåòîâûì
èçëó÷åíèåì
ñ äëèíîé
âîëíû 310 íì.
Ïðåäãèáðèäèçàöèþ
ïðîâîäèëè
ïðè 55îÑ â
òå÷åíèå 1
÷àñà â
ðàñòâîðå 1 (ñì.
Ñêðèíèíã áèáëèîòåêè
êÄÍÊ).
Ãèáðèäèçàöèÿ
äëèëàñü 12-16 ÷àñîâ
ïðè 55îÑ ñ
êîíöåíòðàöèåé
çîíäà íå
áîëåå 10 íã/ìë.
Îòìûâêó
ïðîâîäèëè
äâà ðàçà ïî 10
ìèí â 2-êðàòíîì
SSC + 0,1% SDS ïðè
êîìíàòíîé
òåìïåðàòóðå
è îäèí ðàç 15
ìèí â
1-êðàòíîì SSC + 0,1% SDS
ïðè 55îÑ.
Ýêñïîíèðîâàíèå
äëèëîñü 12
÷àñîâ ïðè -70îÑ
(Ìàíèàòèñ è
äð., 1984).
ÐÅÇÓËÜÒÀÒÛ
ÊÎÍÑÒÐÓÈÐÎÂÀÍÈÅ
ÁÈÁËÈÎÒÅÊÈ
êÄÍÊ È ÅÅ ÑÊÐÈÍÈÍÃ
Â
êà÷åñòâå
èñòî÷íèêà
ìÐÍÊ áðàëè
ëåéêîöèòû
ïåðèôåðè÷åñêîé
êðîâè
ñòåðëÿäè. Íà
îñíîâå ýòîé
ìÐÍÊ
ñèíåçèðîâàëè
êÄÍÊ.
Ïîëó÷åííûå
ìîëåêóëû
êÄÍÊ
êëîíèðîâàëè
â ïëàçìèäíîì
âåêòîðå pBluescript KS(+),
ïîñëå ÷åãî
òðàíñôîðìèðîâàëè
ýòèì âåêòîðîì
êëåòêè E.coli
øòàììà XL-1 Blue MRF’. Â
ðåçóëüòàòå
ýòîãî áûëà
ïîëó÷åíà
áèáëèîòåêà
êÄÍÊ
ïðåäñòàâèòåëüíîñòüþ
6 ìèëëèîíîâ
êëîíîâ.
Áèáëèîòåêó
àìïëèôèöèðîâàëè
äî îáúåìà 5 õ 1011
êëåòîê.
Cóììàðíóþ
ïëàçìèäíóþ
ÄÍÊ
áèáëèîòåêè
âûäåëÿëè è
èñïîëüçîâàëè
â ÏÖÐ ñ ïàðîé
ïðàéìåðîâ,
îäèí èç
êîòîðûõ
ãîìîëîãè÷íåí
ó÷àñòêó âåêòîðà
âáëèçè
ñàéòà
êëîíèðîâàíèÿ
ìîëåêóëû
êÄÍÊ è
ðàñïîëàãàåòñÿ
â êîäèðóþùåé
îðèåíòàöèè.
Âòîðîé
ïðàéìåð
âûðîæäåííûé,
ñîîòâåòñòâóþùèé
íàèáîëåå
êîíñåðâàòèâíîìó
ó÷àñòêó
ïîñëåäîâàòåëüíîñòè
J-ñåãìåíòîâ
L-öåïåé ÈÃ
ïîçâîíî÷íûõ
â
íåêîäèðóþùåé
îðèåíòàöèè
(ðèñ. 10).
Îäèí
èç
ôðàãìåíòîâ
ÄÍÊ,
ïîëó÷åííûõ
â ðåçóëüòàòå
ÏÖÐ,
ñîîòâåòñòâîâàë
îæèäàåìîìó
ðàçìåðó (370 ïí).
Ýòîò
ôðàãìåíò
âûäåëÿëè è
ñóáêëîíèðîâàëè
â âåêòîðå pBluescript KS(+).
Îïðåäåëåíèå
íóêëåîòèäíîé
ïîñëåäîâàòåëüíîñòè
ýòîãî ôðàãìåíòà
ïîêàçàëî,
÷òî îí
ãîìîëîãè÷åí
ãåíàì V
îáëàñòè
L-öåïåé ÈÃ (Ðèñ.
11).
Ýòîò
ôðàãìåíò
áûë
èñïîëüçîâàí
â êà÷åñòâå
çîíäà äëÿ
ñêðèíèíãà
áèáëèîòåêè
êÄÍÊ ëåéêîöèòîâ
ñòåðëÿäè.
Ñêðèíèíã 4000
êîëîíèé áèáëèîòåêè
êÄÍÊ â
ìÿãêèõ
óñëîâèÿõ
ãèáðèäèçàöèè
ïîçâîëèë
âûÿâèòü ïÿòü
êëîíîâ ñ
ðàçìåðîì âñòàâêè
êÄÍÊ îò 800 äî 1050
ïí. Äëÿ
÷åòêîãî
ðàçäåëåíèÿ
êëîíîâ
ïðîâîäèëè
âòîðè÷íûé
ñêðèíèíã
áèáëèîòåêè
êÄÍÊ, ïîñëå
÷åãî
âûäåëåííûå êëîíû
àìïëèôèöèðîâàëè.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17
|
|
