Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди 
Ðèñ.
9. Ñõåìà
ñèíòåçà
êÄÍÊ ïî
ìàòðèöå
ïîëè(A)+ÐÍÊ è
ñøèâêè ñ
ïëàçìèäíûì
âåêòîðîì
pBluescript
KS(+) ïî ñàéòàì EcoR I
è Xho I.
Îáîçíà÷åíèÿ:,,,,, -
ìåòèëèðîâàííàÿ
öåïü êÄÍÊ,
-íåìåòèëèðîâàííàÿ
öåïü êÄÍÊ.
1 ìêë
10-êðàòíîãî
áóôåðà
ëèãèðîâàíèÿ,
1 ìêë 10 ìÌ ðATÔ,
1 ìêë
ôåðìåíòà
ÄÍÊ ëèãàçû
ôàãà Ò4 (4
å.à./ìêë).
Ñìåñü
èíêóáèðîâàëè
ïðè 4îÑ â
òå÷åíèå 2-õ
ñóòîê, ïîñëå
÷åãî
èíàêòèâèðîâàëè
ëèãàçó
ïðîãðåâàíèåì
ïðè 70îÑ â
òå÷åíèå 30
ìèí,
îõëàæäàëè äî
êîìíàòíîé òåìïåðàòóðû
è äîáàâëÿëè
êîìïîíåíòû
äëÿ
ôîñôîðèëèðîâàíèÿ
êîíöåâûõ íóêëåîòèäîâ:
1 ìêë
10-êðàòíîãî
áóôåðà
ëèãèðîâàíèÿ,
2 ìêë 10 ìÌ ðATÔ,
6 ìêë
ñòåðèëüíîé
âîäû,
1 ìêë
ôåðìåíòà
ïîëèíóêëåîòèäíîé
êèíàçû ôàãà
Ò4 (10 å.à./ìêë).
Ðåàêöèîííóþ
ñìåñü
èíêóáèðîâàëè
ïðè 37îÑ â
òå÷åíèå 30
ìèí. Çàòåì
îõëàæäàëè äî
êîìíàòíîé
òåìïåðàòóðû
è äîáàâëÿëè
êîìïîíåíòû
äëÿ
îáðàçîâàíèÿ
ëèïêèõ
êîíöîâ ïî
ñàéòó
ðåñòðèêöèè
ýíäîíóêëåàçû
Xho I:
28 ìêë áóôåðà 4,
3 ìêë Xho I (40 å.à./ìêë).
Ñìåñü
èíêóáèðîâàëè
ïðè 37îÑ â
òå÷åíèå 1,5
÷àñà. Çàòåì
äîáàâëÿëè 5
ìêë
10-êðàòíîãî
áóôåðà STE (1 Ì NaCl, 200
ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 7,5, 100
ìÌ Na2ÝÄÒÀ) è
ïðîïóñêàëè
÷åðåç
êîëîíêó ñ
ãåëåì ñåôàêðèë
Ñ-500. Ôðàêöèè,
ñîäåðæàùèå
ìîëåêóëû ñ ðàçìåðîì
áîëåå 500 ïí
îáúåäèíÿëè
è ýêñòðàãèðîâàëè
ÄÍÊ ðàâíûì
îáúåìîì
ñìåñè
ôåíîë-õëîðîôîðì
(1:1) è ðàâíûì
îáúåìîì
õëîðîôîðìà.
Çàòåì
äîáàâëÿëè
äâîéíîé
îáúåì
ýòàíîëà, îñàæäàëè
êÄÍÊ
öåíòðèôóãèðîâàíèåì,
ïðîìûâàëè 80%
ýòàíîëîì è
ðàñòâîðÿëè â 10
ìêë âîäû. Äëÿ
ëèãèðîâàíèÿ
áðàëè 5 ìêë
ðàñòâîðà
êÄÍÊ (600 íã) è 2 ìêë
ðàñòâîðà
âåêòîðà pBluescript KS(+) (1
ìêã), èìåþùåãî
"ëèïêèå"
äåôîñôîðèëèðîâàííûå
êîíöû ïî
ñàéòàì
ðåñòðèêöèè
ýíäîíóêëåàçàìè
EcoR I è Xho I (ðèñ. 9).
Çàòåì
äîáàâëÿëè 1
ìêë
10-êðàòíîãî
áóôåðà 3, 1 ìêë 10
ìÌ ðàñòâîðà
ðATÔ è 1 ìêë
ôåðìåíòà
ëèãàçû ôàãà
Ò4 (4 å.à./ìêë).
Ñìåñü
èíêóáèðîâàëè
ïðè 4îÑ â
òå÷åíèå 2-õ
ñóòîê, ïîñëå
÷åãî
ýêñòðàãèðîâàëè
ðàâíûìè
îáüåìàìè
ôåíîë-õëîðîôîðìà
è õëîðîôîðìà.
Àìïëèôèêàöèÿ
áèáëèîòåêè.
Ýëåêòðîòðàíñôîðìàöèþ
ïðîâîäèëè
êàê îïèñàíî
â ï.
Òðàíñôîðìàöèÿ
ïðîêàðèîòè÷åñêèõ
êëåòîê, ïîñëå
÷åãî
âûñåâàëè 1/1000
îáúåìà (2,5 ìêë)
ñðåäû SOC íà
ñåëåêòèâíóþ
ñðåäó ñ
àìïèöèëëèíîì
(50 ìêã/ìë) äëÿ
îïðåäåëåíèÿ
êîëè÷åñòâà
òðàíñôîðìèðîâàííûõ
êëåòîê.
Îñòàëüíóþ
÷àñòü ïîìåùàëè
â 100 ìë ñðåäû LB ñ
àìïèöèëëèíîì
(50 ìêã/ìë) è èíêóáèðîâàëè
ïðè 37îÑ ïðè
ïåðåìåøèâàíèè
äî òåõ ïîð,
ïîêà îïòè÷åñêàÿ
ïëîòíîñòü
íå
äîñòèãíåò
âåëè÷èíû D550=2-2,5.
Çàòåì
îòáèðàëè 1,6õ1011
êëåòîê,
îñàæäàëè èõ
öåíòðèôóãèðîâàíèåì,
ñóñïåíäèðîâàëè
â 4 ìë ñðåäû LB è
ïåðåìåøèâàëè
ñ 4 ìë
ãëèöåðèíà.
Ïîëó÷åííóþ
áèáëèîòåêó õðàíèëè
ïðè -70îÑ.
ÏÎËÈÌÅÐÀÇÍÀß
ÖÅÏÍÀß
ÐÅÀÊÖÈß
Ðåàêöèîííàÿ
ñìåñü
ïîëèìåðàçíîé
öåïíîé
ðåàêöèè (ÏÖÐ)
ñîäåðæàëà
ñëåäóþùèå
êîìïîíåíòû:
100 íã ÄÍÊ
ìàòðèöû,
100 íã
íåâûðîæäåííîãî
ïðàéìåðà,
500 íã
âûðîæäåííîãî
ïðàéìåðà,
5 ìêë 2 ìÌ
ðàñòâîðà
äÍTÔ,
5 ìêë
1-êðàòíîãî
áóôåðà (10 ìÌ
òðèñ-HCl, ðÍ 8,8, 50 ìÌ KCl,
1,5 ìÌ MgCl2, 0,001%
æåëàòèí),
1 ìêë Taq
ïîëèìåðàçû,
âîäà äî
êîíå÷íîãî
îáúåìà 50 ìêë
(Dieffenbach and Dveksler, 1995).
Òåìïåðàòóðíûé
ðåæèì ÏÖÐ.
Ðåàêöèîííóþ
ñìåñü
èíêóáèðîâàëè
ïðè 95îÑ â
òå÷åíèå 5
ìèí, ïîñëå
÷åãî
äîáàâëÿëè Taq
ïîëèìåðàçó
è
èñïîëüçîâàëè
òåìïåðàòóðíûé
ðåæèì, ïðè
êîòîðîì â
òå÷åíèå
ïåðâûõ 18
öèêëîâ òåìïåðàòóðó
îòæèãà
ïðàéìåðîâ
ïîíèæàëè íà 3îÑ
÷åðåõ êàæäûå
òðè öèêëà:
1é-18é
öèêëû 95îÑ - 1
ìèí
(äåíàòóðàöèÿ
ÄÍÊ),
50-35îÑ - 1 ìèí
(îòæèã
ïðàéìåðîâ),
72îÑ - 2 ìèí
(ïîëèìåðèçàöèÿ).
19-é-30-é
öèêëû: 95îÑ - 1
ìèí,
50îÑ - 1 ìèí,
72îÑ - 2 ìèí.
31-é
öèêë: 95îÑ - 1
ìèí,
50îÑ - 1 ìèí,
72îÑ - 10 ìèí.
ÑÓÁÊËÎÍÈÐÎÂÀÍÈÅ
ÄÍÊ
Ôðàãìåíòû
ÄÍÊ,
ïîëó÷åííûå
â ðåçóëüòàòå
ÏÖÐ, ðàçäåëÿëè
â 1% àãàðîçíîì
ãåëå è
âûäåëÿëè êàê
îïèñàíî â ï.
Âûäåëåíèå
ÄÍÊ èç ãåëÿ.
Çàòåì
îñàæäàëè
ÄÍÊ
ýòàíîëîì,
ðàñòâîðÿëè â
5-10 ìêë âîäû è
äîáàâëÿëè
êîìïîíåíòû
äëÿ óäàëåíèÿ âûñòóïàþùèõ
íóêëåîòèäîâ
ñ 3' êîíöà ÄÍÊ:
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17
|
|
