Реферат: Мониторинг загрязнения водной среды реки Херота с помощью методов биоиндикации

Результаты биотестирования учитывают при установлении величин предельно допустимых сбросов (ПДС) загрязняю­щих веществ.

Наличие острого токсического действия сточной воды на сбросе в водный объект определяют при кратковременном биотестировании на ракообразных (дафниях или цериодафниях)(10).

Наличие хронического токсического действия сточной природной воды в контрольном и других створах водного объекта определяют при длительном биотестировании на ракообразных (дафниях или цериодафниях).

Для более детальной токсикологической оценки сточ­ной и природной воды биотестирование должно вестись ми­нимум на двух объектах параллельно. Один объект должен относиться к фитопланктону (хлорелла или сцередесмус), другой — к зоопланктону (дафния магна или цериодафния). Предпочтительнее тестировать на хлорелле и цериодафнии, как на более чувствительных объектах.

Пробы сточной воды для биотестирования отбирают, руководствуясь инструкцией по отбору проб для анализа сточных вод НВН 33-5.3.01-85(14); отраслевыми стандартами или другими нормативными документами. Пробы природной во­ды отбирают, руководствуясь ГОСТ 17.1.5.05-85(15).

Биотестирование проб воды проводят не позднее 6 ч после их отбора. Если указанный срок не может быть соб­люден, пробы хранят до двух недель с открытой крышкой внизу холодильника (при +4°С). Не допускается консер­вирование проб с помощью химических консервантов. Перед биотестированием пробы фильтруют через фильтровальную бумагу с размером пор 3,5—10 мкм.

При определении наличия острого и хронического токсического действия воду тестируют без разбавлении. Для учета результатов биотестирования при установлении вели­чин ПДС и определения степени токсичности сточной и при­родной воды готовят серию разбавлении.

Для контроля (вода без токсических веществ) и раз­бавлении используют водопроводную воду, которую дехлори­руют путем отстаивания и аэрирования с помощью микро­компрессоров в течение семи суток. В тех случаях, когда ре­зультаты биотестирования учитывают при установлении ве­личин ПДС, в качестве контрольной и разбавляющей слу­жит природная вода, отобранная вне зоны влияния источни­ка загрязнения и отфильтрованная через фильтровальную бумагу.

Если отсутствует возможность отбора проб из кон­трольного створа, тестируют сточную воду на сбросе в вод­ный объект в разбавлении, соответствующем таковому в кон­трольном створе.

Методика основана на определении изменений выживаемости и плодовитости дафний при воздействии токсических веществ, содержащихся в тестируемой воде по сравнению с контролем.

Кратковременное биотестирование — до 96 ч — позволяет определить острое токсическое действие воды на дафний по их выживаемости. Показателем выживаемости служит среднее количество тест-объектов, выживших в тестируемой воде или в контроле за определенное время. Критерием токсичности является гибель 50 и более процентов дафний за период вре­мени до 96 ч в тестируемой воде по сравнению с контролем.

Длительное биотестирование—20 и более суток — позволя­ет определить хроническое токсическое действие воды на даф­ний по снижению их выживаемости и плодовитости. Пока­зателем выживаемости служит среднее количество исходных самок дафний, выживших в течение биотестирования, пока­зателем плодовитости —среднее количество молоди, выметан­ной в течение биотестирования, в пересчете на одну выжив­шую исходную самку. Критерием токсичности является дос­товерное отличие от контроля показателя выживаемости или плодовитости дафний.

В качестве тест-объекта используют Daphnia magna Straus.

Дафнии обитают в стоячих и слабопроточных водоемах. На территории России дафнии широко распространены. Яв­ляются типичными мезосапробами, переносят осолонение до 6‰.

Рост дафний в течение всей жизни неравномерный, с воз­растом замедляется и связан с периодическими линьками; первые три — ювенильные — следуют через 20, 24, 36 ч, четвертая — созревание яиц в яичнике — и пятая—отклады­вание яиц в выводковую камеру — следуют с интервалом 24—36 ч. Начиная с шестой, каждая линька сопровождает­ся откладыванием яиц. Растет дафния наиболее интенсивно в первые дни после рождения. При хорошем питании раз­меры молодых дафний после каждой линьки удваиваются. Выметанная молодь имеет 0,7—0,9 мм в длину, к моменту половозрелости самки достигают 2,2—2,4 мм, самцы 2,0—2,1мм.

В природе в летнее время, а в лаборатории при благо­приятных условиях круглый год дафнии размножаются без оплодотворения — партеногенетически, причем рождаются в большинстве самки. При резком изменении условий сущест­вования (недостаток пищи, перенаселенность, понижение температуры и т. д.) в популяции дафний появляются сам­цы и дафнии переходят к половому размножению, отклады­вая после оплодотворения «зимние яйца» (1—2 шт.), кото­рые падают на дно водоема, где проходят стадию покоя. Весной из яиц появляются самки, которые в дальнейшем да­ют партеногенетические поколения дафний. Период созрева­ния рачков при оптимальной температуре (20±2°С) и хоро­шем питании 5—8 сут. Наступление половозрелости отме­чают по моменту выхода яйцеклеток в выводковую камеру. Длительность эмбрионального развития обычно 3—4 сут., а при повышении температуры до 25°С — 46 ч вывод моло­ди идет через каждые 3—4 сут. Число яиц в кладке увели­чивается от 10—15 (в первых пометах) до 30—40 и более (у самок среднего возраста), а затем снижается (по мере старения) до 3—8. В лабораторных условиях продолжи­тельность жизни дафний 3—4 мес. и больше.

Исходный материал для лабораторной культуры дафний можно получить в ЦСИАК Краснодарского краевого коми­тета по экологии и природопользованию.

Заранее подготовленные стеклянные сосуды емкостью 3—5 л заполняют на 1/3 объема отфильтрованной природной водой и в них переносят дафний с помощью стеклянной трубки (внутренний диаметр 0,5—0,7 см) с оплавленным или опиленным надфилем концом, чтобы не травмировать рач­ков. Такую трубку используют и в дальнейшем при пересад­ке дафний. Начальная плотность посадки 6 — 10 особей на 1 л воды.

Культуру дафний выращивают в климатостате, люминостате, боксе или помещении, не содержащем токсических па­ров или газов. Оптимальная температура для культивиро­вания дафний и биотестирования составляет 20±2°С, осве­щенность 400—600 лк при продолжительности светового дня 12—14 ч. Не допускают освещения дафний прямыми солнечными лучами. Стеклянную посуду для содержания дафний моют питьевой водой, хромовой смесью или соляной кислотой. Нельзя использовать для мытья синтетические моющие средства и органические растворители. В помеще­нии, где находятся дафнии, не проводят обработку инсекти­цидами, не хранят летучие вещества и не работают с ними. Для культивирования дафний используют водопроводную воду, которую отстаивают и насыщают кислородом с по­мощью микрокомпрессоров не менее 7 сут. Используют так­же природную или аквариумную воду, отфильтрованную че­рез бумажный фильтр. Вода для культивирования должна удовлетворять следующим требованиям: рН 7,0—8,2; жест­кость общая 3—4 мг-экв/л, концентрация растворенного кис­лорода не менее 6,0 мг/л, солевой состав до 6 ‰.

Оптимальная плотность культуры — 25 половозрелых самок в 1 л воды. Раз в 7—10 сут. половину объема воды в сосуде с культурой дафний заменяют на свежую, удаляют сифоном скопившийся на дне осадок и при большой плотнос­ти культуры ее прореживают. Не рекомендуется аэрировать воду в сосудах с дафниями.

Кормом для дафний служат зеленые водоросли (хлорелла или сценедесмус) и хлебопекарные дрожжи. Культуру зеле­ных водорослей выращивают на одной из искусственных питательных средах, которые готовят на дистиллированной воде. Навеску каждого вещества растворяют в небольшом коли­честве воды, а затем растворы сливают вместе в порядке расположения реактивов   (чтобы избежать осадка) и доливают воду до соответствующего объема. Готовят два раствора микроэлементов отдельно (А3 и В2) и вносят их по 1 мл на 1 л среды. Среду Тамия перед посевом водорослей разбавляют дистиллированной водой в 3—5 раз.

Посев водорослей производят альгологически чистой куль­турой, которую выращивают в стерильных условиях. Культуру водорослей вносят в питательную среду в коли­честве, дающем светло-зеленое окрашивание. Исходная кон­центрация около 2 тыс. кл/мл.

Культивируют водоросли в стеклянных кюветах, батарей­ных стаканах или плоскодонных колбах при круглосуточном освещении лампами дневного света 3000 лк и постоянном про­дувании культуры воздухом с помощью микрокомпрессоров. Через 7—10 суток, когда окраска культуры водорослей стано­вится интенсивно зеленой, их отделяют от питательной сре­ды путем центрифугирования или отстаивания в холодильни­ке в течение 2—3 сут. Осадок разбавляют в два раза дис­тиллированной водой. Суспензию хранят в холодильнике не более 14 сут. Водоросли вносят в культуру дафний из расче­та 1 мл суспензии (600—1000 млн. кл/мл) на л воды.

1 — 2 раза в неделю дафний кормят хлебопекарными дрожжами. Для приготовления дрожжевого корма 1 г све­жих или 0,3 г воздушно-сухих дрожжей заливают 100 мл дистиллированной воды. После набухания дрожжи тщатель­но перемешивают. Образовавшуюся суспензию отстаивают в течение 30 мин. Недостающую жидкость добавляют в сосу­ды с дафниями в количестве 3 мл на 1 л воды.

Раствор дрожжей  хранится в холодильнике до двух суток. Можно кормить дафний сырым рисом. Рис пред­варительно размачивают в теплой воде (3—4 ч.) и вносят в культуру из расчета 1 — 2 зерна на 1 л воды. Рис держат в культуре до 10 дней при постоянной продувке мелкодисперсными пузырьками воздуха. При хроническом опыте дафний кормят только хлореллой — по 5 капель на 100 мл(13).

При необходимости биотестирования воды с общим содержанием солей свыше 3 г/л выращивают культуру, адап­тированную к повышенной минерализации среды. Для этого в воду, в которой культивируют дафний и минерализация которой известна, постепенно порциями добавляют хлорис­тый натрий. Вначале его вносят из расчета 500 мг/л. Через неделю минерализацию воды повышают еще на 250 мг/л. Эту операцию повторяют каждую неделю до тех пор, пока содержание солей в среде не достигнет нужного уровня (но не выше 6 г/л с учетом начальной минерализации). В даль­нейшем достигнутый уровень минерализации среды поддер­живают постоянно. Эта же среда служит контролем при биотестировании и в качестве разбавляющей. Адаптированных к повышенному содержанию солей дафний нельзя использовать для тестирования вод с более низким содержанием солей.

Чтобы получить исходный материал для биотестировання, 30—40 самок дафний с выводковыми камерами полными яиц или зародышей, за 1 — 2 сут. До биотестирования переса­живают в 0,5 — 1 л емкости (стаканы, кристаллизаторы) с водой для культивирования, в которую перед посадкой даф­ний вносят корм. После появления молоди (каждая самка может выметать от 10 до 40 молодых дафний) взрослых особей удаляют.

При кратковременном биотестировании используют толь­ко односуточных дафний, а двухсуточных самок — при дли­тельном биотестировании.

Перед началом биотестирования в пробе воды определя­ют концентрацию растворенного кислорода, которая должна быть не менее 6,0 мг/л (оптимально 6,0 —7,0). Если она ни­же 6,0 мг/л, то перед биотестированием воду аэрируют с по­мощью микрокомпрессора. В процессе биотестирования аэри­ровать воду не рекомендуется. Биотестирование проводят при тех же условиях, что и культивировании. Ре­зультаты биотестирования считают правильными, если ги­бель дафний в контроле не превышает 10% в остром опыте и 25% в хроническом и концентрация растворенного в тес­тируемой воде кислорода в конце биотестирования составля­ет не менее 2 мг/л.

Для определения наличия острого токсического дейст­вия сточной воды на сбросе в водный объект воду тестиру­ют без разбавления. Если требуется сравнить степень токсичности сточной воды, отобранной из разных мест или в разное время, готовят серию разбавлении (не менее трех).

Объем пробы воды для биотестирования без разбавле­ния — 500 мл, с учетом разбавлении — 1 л.

Посадку дафний в сосуды для биотестирования проводят следующим способом: стеклянной трубкой диаметром 0,5 — 0,7 см отлавливают дафний из культуры, помещают в сачок из планктонного газа, погрузив его в тестируемую воду, пе­реводят в нее дафний, посадку ведут от разбавлении тести­руемой воды с большей кратностью к меньшей.

В сосуды наливают по 300 мл контрольной и тестируе­мой воды или ее разбавлении. Повторность трехкратная. В каждый сосуд помещают по 10 односуточных дафний и экспонируют при оптимальных условиях в тече­ние времени до 96 ч. При кратковременном биотестировании дафний не кормят.

Учет выживших дафний проводят через 1, 6, 24, 48, 72, 96 ч. Особей считают выжившими, если они свободно передвигаются в толще воды или всплывают со дна сосуда не позднее 15 с после его легкого покачивания. Если в любой считываемый период времени в сточной воде гибнет 50 и более процентов дафний, биотестирование прекращают.

Для определения наличия хронического токсического действия воды в контрольном и других створах водного объекта воду тестируют без разбавления. Если требуется сравнить степень токсичности разных проб воды или ис­пользовать результаты биотестирования при установлении величин ПДС, готовят серию разбавлении. Определяют ми­нимальную кратность разбавления, при которой хроническое токсическое действие не проявляется.

Объем пробы воды для биотестирования без разбавле­ния — 1 л, с учетом разбавлении — 3 — 5 л.

В сосуды наливают по 300 мл контрольной и тестируе­мой воды или ее разбавлении. Повторность трехкратная. В каждый сосуд вносят одинаковое количество корма, поме­щают по 10 двухсуточных самок дафний и экспонируют при оптимальных условиях. Дафний кормят ежесу­точно. Три раза в неделю в сосудах с дафниями производят смену контрольной и тестируемой воды на свежеотобранную. При смене воды дафний кормят за 3 ч до смены. Допуска­ется использовать воду, хранящуюся в холодильнике.

С момента появления молоди, в те сутки, когда меняют воду, производят учет выживших исходных самок и выме­танной молоди. Для этого самок с помощью стеклянной трубки пересаживают в заранее подготовленные сосуды с контрольной и тестируемой водой (соответственно) и под­считывают их количество в каждом сосуде. Оставшуюся во­ду процеживают через сито из планктонного газа. При этом на сите остается выметанная молодь, которую подсчитыва­ют и удаляют.

После того, как в контроле все исходные самки дадут по четыре помета, биотестирование заканчивают.  Время биотестирования сокращается, если при промежуточном под­счете устанавливают достоверное отличие от контроля пока­зателя выживаемости или плодовитости дафний.

 При биотестировании сточной воды на сбросе в водный объект рассчитывают процент по­гибших дафний в тестируемой воде по сравнению с контро­лем

А = (N2/N1) * 100%                                                                                (3.1)

N1 – среднее арифметическое        количество дафний,     вы­живших в контроле;

N2 – среднее арифметическое        количество дафний,     вы­живших в тестируемой         воде.

Если А>50%, тестируемая вода оказывает острое токсиче­ское действие, если А<50%, тестируемая вода не оказывает острого токсического действия на дафний.

Для определения степени острого токсического действия те­стируемой воды рассчитывают графическим методом:

ЛКр50-96 ч — кратность разбавления тестируемой воды, при которой гибнет 50% дафний за 96 ч;

ЛКр0-96 ч — минимальную кратность разбавления, при ко­торой дафнии не гибнут за 96 ч.

На оси абсцисс откладывают логарифмы величин кратности разбавлении тестируемой воды, а на оси ординат — ­средние арифметические величины выживаемости дафний в процентах к контролю. Полученные точки соединяют прямой. От точек на оси ординат, соответствующих 50 и 100% выживаемости, проводят линии, параллельные оси абсцисс. Из то­чек пересечения этих линий с экспериментальной прямой опускают перпендикуляры на ось абсцисс и находят лога­рифмы величин кратности разбавлении, которые будут со­ответствовать исковым величинам ЛКр50 и ЛКро. Чем боль­ше величины ЛКр50 и ЛКро, тем токсичнее тестируемая вода.

Степень токсичности можно также установить, рассчитав ЛКр50 — среднее время гибели 50% дафний в тестируемой воде. Для этого строят график (на оси абсцисс откладывают время наблюдения, на оси ординат — выживаемость в процентах к контролю). Чем меньше ЛКр50, тем токсичнее тестируемая вода.

При биотестировании воды из контрольного или других створов водного объекта вывод о наличии хронического токсического действия делают на основании установления достоверности различия между показате­лем выживаемости или плодовитости дафний в контроле и в тестируемой воде. Для этого рассчитывают среднее арифметическое показателей выживаемости и пло­довитости в контрольной и тестируемой воде

Результаты биотестирования разбавлении тестируемой воды с целью их использования при установлении величин ПДС или определения степени хронического токсического действия тес­тируемой воды обрабатывают с помощью вышеописанных приемов. Определяют минимальную кратность разбавления тестируемой воды, при которой различия между величинами показателей выживаемости и плодовитости дафний в конт­роле и соответствующем разбавлении будут недостоверными.

Если получают две разные величины минимальной крат­ности разбавления тестируемой воды (одну, при которой не­достоверным будет отличие от контроля показателя выжива­емости, и другую, при которой недостоверным окажется от­личие от контроля показателя плодовитости), вывод об от­сутствии хронического токсического действия на дафний де­лают на основании большей величины.

Периодически, не реже одного раза в месяц, необходимо проводить контроль чувствительности дафний и цериодафний к «эталонному» токсиканту бихромату калия (K2Cr2O7). Концентрация бихромата калия, которая в тече­ние 24 часов иммобилизует 50% дафний, взятых для экспе­римента, должна находиться в диапазоне 0,9—2,0 мг/л. Ука­занный диапазон концентраций вызывает 50%-ную иммоби­лизацию дафний и цериодафний. Испытания проводятся в соответствии с общими требованиями для биотестирования. Используется для испытания, бихромат приз­нанного аналитического качества. Если результаты опытов не укладываются в указанный интервал, т» следует прове­рить правильность приготовления исследуемых растворов, соблюдение условий проведения опытов, правильность выбо­ра возраста рачков. Если ошибки исключены, следует заме­нить культуру, получив ее в базовых лабораториях по био­тестированию.

Биотестирование является дополнительным экспери­ментальным приемом для проверки необходимости корректи­ровки величин ПДС по интегральному показателю «токсич­ность воды», который позволяет учесть ряд существенных факторов: наличие в сточной воде токсических веществ, не­учтенных при установлении ПДС, вновь образовавшихся со­единений, метаболитов, различные виды взаимодействий химических веществ — синергизм, антагонизм, аддитивность и т. д.

Страницы: 1, 2, 3, 4