Выделение чистых культур дрожжевых грибов из шишек хмеля

После доказательства полифилетической природы таких крупных дрожжевых родов, как Candida, в зимологии начался активный поиск признаков, которые могли бы дифференцировать анаморфы аско- и базидиомицетов. К настоящему времени в систематике дрожжей используется целый набор таких признаков аффинитета, благодаря которым все дрожжи удается четко разбить на две группы - аскомицетовые и базидиомицетовые, независимо от телеоморфного или анаморфного состояния культуры.

Развитие методов секвенирования рРНК окончательно решило проблему определения аффинитета несовершенных дрожжей. Одно из главных преимуществ систематики, основанной на сравнении нуклеотидных последовательностей консервативных генов - возможность классификации на одной и той же основе как совершенных видов дрожжей, обладающих полным жизненным циклом, так и их анаморф.( Розманова Н.В., Бочарова Н.Н.).

Вновь описываемые виды должны типифицироваться штаммами, которые помещают в крупные коллекции, где они поддерживаются в живом состоянии. Это делает их доступными для научной общественности. Кроме хранилищ таких штаммов коллекции выполняют различные функции: научные, учебные, производственные. Они проводят патентование практически ценных штаммов, осуществляют обмен и выдачу культур для разных целей, проводят таксономические исследования, составляют периодически публикуемые каталоги. Коллекции дрожжей различаются как по своему объему, так и по направленности. Есть очень крупные, хорошо известные в научном мире коллекции, где проводятся широкие исследования по систематике дрожжей, разрабатываются способы наилучшего хранения штаммов. Есть и небольшие, но очень ценные коллекции, где собраны штаммы с конкретной целью, служащие для выполнения специальных исследований.( Жвирблянская А.Ю., Исаева В.С.).

Крупнейшая коллекция дрожжей - CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures). Эта коллекция была создана в 1904 г. по решению 11-го международного Ботанического Конгресса в Вене. Она поддерживается Королевской Нидерландской Академией Искусств и Наук и до 2000 г. располагалась на родине Левенгука в г. Дельфте. В настоящее время коллекция CBS находится в г.Утрехте и является мировым центром по изучению систематики дрожжей. Главным образом на базе этой коллекции была создана серия определителей дрожжей, содержащих описания всех известных видов и диагностические ключи для их идентификации.( Бабьева И.П., Голубев В. И.).

Среди других крупных коллекций дрожжей ВКМ (Всероссийская коллекция микроорганизмов) и ВКПМ (Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов) в России, ATCC (American Type Culture Collection) в США, IFO (Institute of Fermentation in Osaka) в Японии, CCY (Culture Collection of Yeasts) в Словакии, NCYC (National Collection of Yeast Cultures of the United Kingdom) в Англии. Существует также ряд крупных специализированных коллекций дрожжей, например, генетически модифицированных штаммов Saccharomyces cerevisiae, штаммов, используемых в виноделии и других биотехнологических процессах.

Основная проблема, с которой сталкиваются работники микробиологических коллекций - необходимость длительного поддержания чистых культур в жизнеспособном состоянии. Для хранения дрожжевых культур используются разные методы, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки.( Бабицкая В.Г., Стахеев И.В.).

Наиболее доступный и широко применяемый метод хранения - поддержание культур путем их периодических пересевов, обычно в пробирках со скошенным агаром. Сроки пересевов определяются скоростью высыхания среды и зависят от температуры и влажности помещения. Промежутки между пересевами можно увеличить за счет более плотного закупоривания пробирок и снижения температуры хранения. Хранение в холодильной камере при температуре около 5°C дает возможность увеличить сроки пересевов до 2-3 лет. Для предотвращения высыхания культур используют заливку культур минеральным маслом. Этот способ позволяет сохранять культуры большинства видов дрожжей без пересевов в течение 10 и более лет.( Аркадьева З.А.).

Другой способ, используемый для длительного хранения дрожжевых культур - лиофилизация, то есть высушивание под вакуумом из замороженного состояния. Лиофилизированные культуры хранят в запаянных стеклянных ампулах при комнатной температуре или в холодильнике. Такие культуры могут сохраняться в жизнеспособном состоянии в течение нескольких десятилетий.

Недостатком этого способа является невозможность визуального контроля за жизнеспособностью культуры. Кроме того, не все виды дрожжей выдерживают процесс лиофилизации, а при длительном хранении лиофилизированных культур могут происходит существенные изменения в их метаболизме.( Хиггинс И., Бест Д., Джонс Д.М).

В последнее время все шире применяется еще один способ длительного хранения культур микроорганизмов - замораживание в жидком азоте. Замороженные в ампулах культуры хранят в специальных контейнерах-рефрижераторах с жидким азотом при температуре -196°C. Такой способ позволяет сохранять жизнеспособные культуры дрожжей в течение практически неограниченного времени.( Безбородов А.М.).

Определение видовой принадлежности дрожжей - сложная процедура, требующая не только большого опыта, но и, как правило, достаточно длительных лабораторных исследований, связанных с постановкой серии тестов для определения рассмотренных выше морфологических, физиологических и биохимических признаков. Лишь после составления достаточно полного описания штамма возможна его надежная видовая идентификация. В последнее время для идентификации дрожжей по таким описаниям, наряду с традиционными дихотомическими ключами, широко используются компьютерные технологии нумерической идентификации. Такая идентификация может осуществляться на основе любой СУБД (средство управления базами данных), в которую внесены стандартизованные признаки всех видов дрожжей. В процессе идентификации программа поочередно сравнивает описание идентифицируемого штамма с описанием каждого вида и высчитывает уровень сходства (долю совпавших признаков от общего количества использованных признаков). Результирующая информация представляет собой список видов, ранжированный по уровню сходства с идентифицируемым штаммом. Существуют специализированные программы для идентификации дрожжей. (Розманова Н.В., Бочарова Н.Н.).

Некоторые коллекции дрожжей предоставляют возможность поиска наиболее сходных штаммов с использованием Интернета. В последние годы бурно развивается система генобанков, доступных также через Интернет, позволяющих искать наиболее сходные нуклеотидные последовательности. Однако следует помнить, что при идентификации с использованием таких формальных процедур возможны серьезные ошибки, поэтому для надежного определения вида дрожжей необходима консультация со специалистом-систематиком, имеющим большой опыт изучения разнообразия этих организмов. В первую очередь это относится к идентификации штаммов, выделенных из природных местообитаний.

2 Общая характеристика хмеля

Humulus lupulus L

Название рода humulus – средневековое латинизированное славянское или голландское наименование хмеля, латинское “lupulus” – от итальянского “luppolo” – хмель.

Двудомное многолетнее травянистое вьющееся растение (лиана). Стебель длиной до 3 – 6 м, гранистый, цепкошероховатый от загнутых шипиков. Корневище мясистое, ползучее.

Листья супротивные, на верхушечных ветках иногда очередные, черешковые, округлые или овальные, трех-, пятипальчатолопастные, по краю крупнопильчатые с остроконечными зубцами, сверху темно-зеленые, острошероховатые, снизу более бледные, железистые, по жилкам с редкими острыми цепкими шипиками. Черешки длинные, шероховатые. (Н.И. Ляшенко, 1976).

Цветки мелкие, однополые; растение двудомное – пестичные и тычиночные цветки развиваются на разных экземплярах. Тычиночные (мужские) цветки на тонких цветоножках, поникшие, с пятичленным, желтовато-зеленым околоцветником, расположены пазушными верхушечными висячими метелками. Пестичные цветки (женские) на очень коротких цветоножках находятся в коротких пазушных колосках, длиной 2 – 3 см. Околоцветник малозаметный, чашевидный, плотно охватывает нижнюю половину завязи. Прицветники после цветения разрастаются, образуя “шишки”. Плод – килеватый сплющенный орешек. “Шишки” несут желтые железки. Цветет в июле – августе. (В.М. Шуляр, И.Г. Рейтман, С.А. Зинчинко, 1980).

Растет по берегам рек в зарослях кустарников и по опушкам пойменных лесов. Распространен почти по всей европейской части России, на Кавказе, в Сибири, Средней Азии. Широко возделывается на Украине, в Беларуси, Поволжье, Восточной и Западной Сибири, в центрально-черноземных областях, на Алтае и Кавказе. (А.Н. Александров, 1975)

Заготовляют шишки в начале созревания (август, начало сентября), срывая руками, когда они еще зеленовато-желтого цвета. Сушат быстро под открытым небом, в тени, на чердаках или под навесом с хорошей вентиляцией, расстилая их тонким слоем на мешковине или бумаге. Лучшее сырье получается при сушке в сушилках. Не следует забывать, что хмель ядовит.

Железки, находящиеся на составных частях соплодий (“шишках”), во время созревания легко отделяются. Путем отряхивания “шишек” и просеивания получают зеленовато-желтый порошок из железок, называемый лупулином. Железки, иногда называемые липучки, составляют 7—16% массы сухих “шишек”.(В.Н. Виноградов, Л.Сергеев, 1977)

Корневая система вегетативно размножаемых растений хмеля состоит из 10-12 и более сильно разветвленных толстых скелетных корней, покрытых корообразным слоем. Корни отрастают из главного корневища – подземного видоизмененного побега. Скелетные корни многократно ветвятся на более тонкие корни с густой сетью мелких корешков и образуют мощную корневую систему, проникающую в глубину до 4 метров и в ширину до 3 метров.

Конечные разветвления корешков имеют корневой кончик, который постоянно нарастает. За корневым кончиком расположена небольшая всасывающая зона корешков, покрытая корневыми волосками, которые представляют собой отростки клеток эпидермиса с очень тонкой оболочкой.

Корневые волоски, поглощающие воду и питательные вещества из почвы, перемещаются за растущим кончиком корня.

По данным Крыловой М.И.(С.А. Коновалов, 1962) и других исследователей после отмирания корневых волосков на поверхности корешка остается только первичная корка, клетки которой имеют корообразные стенки и защищают внутреннюю ткань корня от повреждений и высыхания.

Кроме того, на подземной части стеблей, главном и боковых корневищах образуются мелкие мочковатые корешки, произрастающие главным образом в пахотном горизонте. Они покрыты тонким корообразным слоем, имеют более светлую окраску, чем скелетные корни. Многолетние корни хмеля являются резервными органами. В толстых корнях и в особых корневых утолщениях накапливаются запасные питательнее вещества. Эти корневые утолщения образуются на корнях примерно, на расстоянии 40 см от главного корневища и имеют продолговатую форму.

В течение вегетационного периода по данным И.Г. Рейтмана, Н.И. Ляшенко, М.А. Кулинич (1983), у хмеля наблюдается два периода роста корней - весеннее – летний и осенний. Первый период предшествует активному росту надземной массы и сопровождается усиленным приростом корней в длину. Вторая волна роста корней - осенняя, в период затухания роста стеблей. В этот период особенно усиленно идет процесс накопления общей массы корней и отложения в ней запасных питательных веществ.

Виноградов В.Н. (1977) утверждает, что главное корневище хмеля представляет собой многолетний подземный орган побегового происхождения (ботаническое название каудекс) с расположенными на нем почками. У плодоносящего растения его диаметр достигает 15 см. С возрастом главное корневище разрастается и сильно деревенеет, причем в год посадки разрастание главного корневища вначале происходит медленно, а после образования мощной надземной части растения- более интенсивно. Самым большим прирост главного корневища хмеля бывает в первые 3-4 года после посадки растения. Именно в этот период на нем образуется наибольшее количество почек.

По некоторым данным на главном корневище хмеля ежегодно образуются боковые корневища – видоизмененные, развивающиеся в горизонтальном направлении подземные побеги с почками. Боковые корневища имеют относительно короткие междоузлия, они развиваются за счет резервных веществ подземной части растения.

Стебли у хмеля тонкие, длинные вьющиеся лианы. При толщине не более 13 мм, они достигают в длину 10-12 метров, а потому не могут самостоятельно держаться вертикально и пользуются для этого соседними растениями или другими опорами.

Характерной особенностью строения стебля хмеля как лианы является отсутствие прочного скелета, наличие крупных длинных проводящих сосудов и облегченная масса растения за счет небольшого запаса питательных веществ в самих стеблях и полного их строения. Прочность и гибкость стебля хмеля по данным (Либацкого Е.П. А.Б. Остроменьский 1979) обеспечивается особенностью его строения: наличием лубяных волокон в стенках стебля и диафрагм в его узлах.

Побег хмеля представляет собой стебель с листьями и другими расположенными на нем органами, имеет свои особенности.

Листья у хмеля простые черешковые с небольшими прилистниками у основания. Черешки листьев имеют ту же окраску, что и стебли. Поверхность листовой пластинки пальчатораздельная, у основания сердцевидной формы (А.Б Остроменьский, 1979).

Соплодия (“шишки”) хмеля содержат 0,3—1,8% эфирного масла, 11—21% горечей, называемых общими смолами. Компонентами этих “смол” являются кислоты: гумулон, когумулон, адгумулон и другие, горькое вещество лупулин, сесквитерпены. Кроме того, соплодия содержат валериановую и гумуленовую кислоты, следы алкалоидов (алкалоид хумулин), холин, дубильные вещества (3,5%). Фенольные соединения представлены флавоноидами (кемпферол, кверцетин и их гликозиды, лейкоцианидин, лейкодельфинидин), кумаринами, фенольными кислотами.

Мужские соцветия хмеля представляют собой сильно разветвленную метелку, на которой по одиночке на коротких цветоножках расположены мелкие цветки. На одном мужском растении находится очень большое количество цветков. Мужские цветки начинают цвести на 3-4 дня раньше женских (В.Н. Виноградов, Л. Сергеев, 1977). Свежесобранный хмель содержит большое количество воды (около 75%), хмелевые смолы, дубильные вещества и эфирное масло, участвующие в технологическом процессе при производстве пива и являющийся ценным сырьем используемым в медицине, косметологии и идругих отраслях промышленности (В.И. Вержбицкий, В.Д. Полищук, 1975).

В литературе есть данные согласно которым до 1950 года были известны только две составляющие группы хмелевых смол, первоначально считавшиеся химическими индивидуумами (В.М. Бондаренко 1959), а именно альфа-горькая кислота, или гумулон и бета-горькая кислота или лупулон.

Сбор хмеля начинается, как только шишки закрываются и приобретают желто-зеленую окраску, а также клейкость и аромат. В зависимости от месяца произрастания наиболее благоприятное время для сбора шишек – август − сентябрь. Ощипанные шишки содержат много воды, поэтому их сушат (обычно в специальных сушилках, можно и в печи) при температуре никак не выше 50°С.

Однако А.Б. Остроменьский (1979) указывает на быстрое снижение качества хмеля после наступления технической зрелости, в связи, с чем рекомендует сжатые сроки уборки (10-15 суток).

К такому же выводу пришли В.М. Шуляр, И.Г. Рейтман, С.А. Зинчинко (1980) которые исходя из результатов своих исследований рекомендуют убирать хмель в течении 6-8 суток.

У большого числа сортов хмеля цианидины, или цианигены во много раз преобладают над делфинидином или делфинигеном .

Было установлено Е.П Либацкий (1993), что хмель содержит катехин, эпикатехин и их полимеры. По данным Роллмана (1966) катехин является вторым компонетом основного бифлавоидного антоцианогена хмеля.

Хмелевое эфирное масло придает хмелю характерный аромат, это сложная смесь углеводородов и кислородсодержащих соединений.

С помощью газовой хроматографии постепенно удалось идентифицировать большое число компонентов хмелевого эфирного масла. По данным Лященко (Н.И. Ляшенко, 1977) их насчитывается около двухсот.

Углеводородная (терпеновая) фракция составляет от 40 до 80% хмелевого эфирного масла. Как правило, половина этой фракции - это монотерпены, остаток – главным образом секситерпены. Основной монотерпен- это мирцен, основные сексвитерпены – кариофилены, гумулен и фарнезен. Образование и качественный состав хмелевого эфирного масла также как и горьких веществ является генетическим свойством отдельных сортов хмеля (F. Drawert, J Beier, J Beier, 1973).

По некоторым данным A.H. Burgess (1967) мирцен придает пиву резкий запах и жесткий вкус, в то время как гумулен и кариофилены придают пиву благородный аромат. Соотношение кариофиленов, гумулена и фарнезена зависит у одного и того же сорта хмеля от района его произрастания (Д.А. Гарбузова, 1959).

В состав кислородсодержащей фракции входят спирты, альдегиды и сложные эфиры спиртов.

Основной, с технологической точки зрения несущественной частью хмелевых шишек является клетчатка (целлюлоза). Из других высокомолекулярных полисахаридов хмель содержит от 12 до 14% пектина. Из растворимых сахаридов в сухом веществе хмеля содержится: 0,5% фруктозы, 0,4% глюкозы, 0,5% сахарозы Б.В. Лесик, И.Г. (Рейтман, В.М. Шуляр, 1983).

В хмеле были обнаружены эстрогенный гормон (от 2 до 30 мг на 100 грамм хмеля) и некоторые витамины, а именно тиамин, биотин, пиридоксин, пантотеновую и пантотеновую кислоты. По содержанию токоферолов (витамина Е) хмель превосходит зародыши пшеницы служащие сыръем для получения токоферолов. Если в зародышах пшеницы их содержание примерно 30 мг %, то по данным Ежова И.С. в зависимости от сорта оно варьирует от 18 до 71 мг%. Кроме токоферолов в хмеле содержатся водорастворимые витамины: С, В1, В3 , В6, РР и Н (А.Ю. Жвирблянская, В.С. Исаева, 1979). Химический состав по некоторым данным в различных частях растения неодинаков. Установлено, что содержание горьких веществ в шишках хмеля уменьшается от верхних частей растений к нижним, больше всего их содержится в шишках верхней части растения, меньше – в шишках средней части растения и еще меньше в нижней части.

Режим сушки для сохранения качеств хмеля, как и своевременная уборка, имеет первостепенное значение. Особенно осторожно следует обращаться с чересчур сырым хмелем, при сушке которого можно потерять хмелевое масло, которое легко испаряется. Хмелевая мука буреет и разрушается уже при 37°С. Высушенный хмель содержит 10…12% влаги. Для хранения его упаковывают в мешки (желательно из джута) или прессуют.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9