Регистрация сигнальных молекул
Регистрация сигнальных молекул
содержание
|
|
стр.
|
Список сокращений
|
|
введение
|
|
1. обзор литературы
|
|
1.1. Использование Ti-плазмид агробактерий в генетической
инженерии
|
|
1.1.1. Краткая характеристика Agrobacterium tumefaciens
|
|
1.1.2. Cоздание векторов на основе Ti-плазмид
|
|
1.1.3. Процессинг тДНК в бактериальной клетке
и ее перенос в клетки растений
|
|
1.1.4. Разработка система трансформаций растений с
помощью Agrobacterium tumefaciens
|
|
1.1.5. Проблема сохранения чужеродных генов,
перенесенных в растение
|
|
1.1.6. Анализ экспрессии чужеродных генов в
трансформированных растениях
|
|
1.2. Использование метода генетической
инженерии для трансформации однодольных растений
|
|
1.2.1. Краткие характеристики ряски
|
|
1.3.
Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг тДНК
|
|
2. Материалы и методы
|
|
2.1. Материалы
|
|
2.1.1.
Оборудование
|
|
2.1.2.
Бактериальные штаммы и плазмиды
|
|
2.1.3.
Растения
|
|
2.1.4.
Среды микробиологические для
культивирования
растений
|
|
2.1.5.
Другие растворы
|
|
2.1.6.
Ферменты, используемые в генной инженерии
|
|
2.1.7.
Антибиотики
|
|
2.2.
Методы
|
|
2.2.1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с
экссудатами тканей растений
|
|
2.2.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacterium tumefaciens
|
|
2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по Саузерну
|
|
2.2.4. Трансформация клеток Esherichia coli
|
|
3. результаты
|
|
4. обсуждение
|
|
5. выводы
|
|
литературы
|
|
приложение
|
|
СПИСОК СОкРАЩЕНИЙ
НУК – нафтиуксусная кислота
БАП – бензиламинопурин
MS –
LB –
тДНК –
Ар – ампицилин
Cs – цефотоксин
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность
работы:
Свойство бактерий
вида Agrobacterium
tumefaciens вызывать у растений корончато-галловую болезнь связано с
присутствием в их клетках крупных (95-156 мДа) конъюгированных Ti-плазмид (от англ. tumor-inducing – вызывающий опухоль). В
процессе идентифицирования растений часть генетического материала Ti-плазмид – тДНК (от англ. transferred DNA – передаваемая) перемещается в
растительные клетки и интегрируется в хромосомы, оставаясь частью
наследственного материала. Гены тДНК экспрессируются в трансформарованных
растительных клетках, нарушают их фитогормональный баланс и определяют синтез
специфических ------- соединений.
Таким образом,
агробактерии являются природными "генными инженерами", осуществляющий
поразительный по филогенетической дальности перенос генетической информации. На
основе агробактерий сконструированы эффективные векторные системы для
генетической инженерии растений.
Агробактириальная
трансформация происходит в результате сложного процесса взаимодействия между
бактериальными и растительными клетками. В этом процессе одной из решающих
стадий является рецепция агробактериями особых сигнальных молекул,
присутствующих в экссудатах поврежденных тканей растений. Сигнальные молекулы
индуцируют экспрессию генов области vir (агробактериальных Ti-плазмид), контролирующих вырезание тДНК и ее
перенос в клетки растений. Агробактерильная трансформация наблюдается у
широкого круга голосеменных и двудольных растений, однако, она отмечена лишь у
весьма незначительного числа однодольных растений. Одной из причин ограничений
агробактериальной трансформации однодольных считается присутствие в их клетках
сигнальных молекул, индуцирующих процессинг и перенос тДНК.
Цель работы:
В настоящее время имеются противоречивые данные относительно наличия
таких сигнальных молекул у однодольных растений. В связи с этим, целью данной
работы был анализ ряски на присутствие у них сигнальных молекул, индуцирующих
процессинг тДНК.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Использование Ti-плазмид агробактерий в
генетической инженерии растений
1.1.1.
Краткая характеристика Agrobacterium tumefaciens
За последнее десятилетие в области генетической
инженерии растений достигнуты значительные успехи. Были разработаны
разнообразные методы генетической трансформации и, в настоящее время
осуществлена экспрессия чужеродных генов в растениях многих видов. Наиболее
важным для развития генетической инженерии растений было открытие молекулярных
основ опухолевых образований с помощью Agrobacterium tumefaciens [7].
Вирулентные штаммы Agrobacterium tumefaciens (сем. Rirobiaceae) характеризуются присутствием в
клетках большой плазмиды, так называемой Ti-плазмиды, весом более 150 т.п.н.
(см. Приложение) [9].
Агробактерии вызывают опухолевый рост у многих
двудольных и голосеменных, а так же у некоторых однодольных растений [2,3]. Для инфицирования in vivo необходимо повреждение
тканей растения [12].
После прикрепления к клеточной стенке растительной
клетки агробактерии переносят часть Ti-плазмиды (так называемой тДНК) в ядро,
где происходит ее стабильная интеграция в хромосому растения.
Доказано, что функция распознавания клеток и
прикрепления к ним, а так же вырезание, перенос и, возможно, интеграция тДНК в
растительный геном кодируется двумя хромосомными генами – Chva и Chvb [13] и рядом генов vir-области, находящихся на Ti-плазмиде [14].
После переноса в ядро растительной клетки, тДНК может
интегрировать в геном в виде одной или нескольких копий [15]. Встроенная тДНК имеет свойства,
характерные для ДНК эукариот, что показано в экспериментах по
гиперчувствительности к ДНК-азе I (Schafer, 1984). В зависимости от типа Ti-плазмиды, в тДНК находится от семи
до тринадцати генов, ответственных за опухолевый фенотип. Гены 1 и 2 кодируют
ферменты, участвующие в синтезе ауксина, индолилуксусной кислоты, в то время,
как ген 4 кодирует изопентенилтрансферазу, синтезирующую цитокинин изопентенила
денозин 5'-монофосфат [16].
Одновременная транскрипция генов 1,2 и 4 приводит к
повышению уровня фитогормонов внутри трансформированных клеток. Результатом
этого является повышение митотической активности и образование опухоли. Другие
гены тДНК кодируют синтез так называемых опинов, из которых наиболее изучены
нопапин и октопин. Опины представляет собой производное аминокислот и сахаров,
которые служат источником питания для агробактерий [14]. В целом, образование корончатого
галла представляет собой хорошо охарактеризованный пример генетической
инженерии растений в природе.
Мутации в вирулентных генах
агробактерий.
Наличие Ti-плазмид в клетках агробактерий является абсолютно необходимым
условием патогенности микроорганизма. Излеченные от Ti-плазмид штаммы
агробактерий авирулентны. На вирулентность Agrobacterium tumefaciens оказывают
влияние различные мутации, картируемые как на опухолевых плазмидах, так и на
хромосомах. Ранние этапы взаимодействия агробактерий с растениями, так же как
хемотаксис, прикрепление к поверхности растительной клетки и специфическое
связывание в центрах инфекции контролируются генами, имеющими хромосомную
локализацию. В хромосоме расположены некоторые гены, регулирующие экспрессию vir-генов Ti-плазмид [19]. Присоединение агробактерий к
клеткам растения является одним из первых этапов, определяющих эффективное
взаимодействие. Этот этап у Agrobacterium tumefaciens контролируют два
связанных между собой хромосомных локуса Chva и Chvb, размерами 1,5 kb и 5kb, соответственно [Дуглас и др, 1985]. Гены этих локусов экспрессируются
конститутивно. В результате транспозонного мутагенеза этих областей получают
авирулентные или дефекнтые по прикреплению агробактерии. Мутации в этих
локусах сильно понижают или ингибируют вирулентность бактерии, но не для всех
хозяев. Локус Chvb
определяет синтез нейтрального циклического b-D-гликана, который трансформируется в периплазматическое пространство клетки
с помощью продукта гена Chva.
Роль нейтрального b-D-гликана в инфекционном
процессе еще точно не установлена. Помимо циклического b-D-гликана в прикреплении патогенных
агробактерий к растительным клеткам принимают участие и другие полисахариды, в
частности внеклеточные экзополисахариды.
Организация vir-генов Ti-плазмид. Вирулентные гены агробактерий на
Ti- и Ri-плазмидах кластеризованы в
области vir разметом около 30-35 kb, проявляющей в этих плазмидах
значительную гомологию ДНК. Выявлена также гомология vir-генов Ti-плазмид Agrobacterium
tumefaciens с tra-генами конъюгитивных плазмид.
В ----- Ti-плазмидах в области vir
локализовано шесть различных групп комплементации A, B, C, D, E и G, организованных в единый регулон [Stachel Nester, 1986]. Октопиновая Ti-плазмида Arh 5 имеет дополнительный локус vir F, расположенный справа от локуса vir E [Kooykaas et al., 1984]. Мутации в генах и ---------
vir A, vir G, vir B и vir D придают агробактериям
авирулентный фенотип, в отличие от большинства хромосомных мутаций, имеющих
круг трансформируемых растений-хозяев.
Продукты генов vir-области контролируют процессинг тДНК в бактериальной клетке, ее перенос в
растительную клетку и интеграцию в ядерный геном растения, причем эти процессы
гены vir могут определять не только в
цис, но и в транс положении по отношению к тДНК (то есть находясь в разных
репликонах). Исходя из этого свойства области vir, сконструированы и успешно используются в практике
удобные бинарные векторы для генетической инженерии растений [Дрейпер с соавт, 1991]. Для процессов
"вырезания" тДНК из плазмиды (точнее, высвобождения в процессе
репликативного синтеза) и ее переноса в растение необходимо фланкирование этой
области особыми границами: несовершенными прямыми повторяющимися
последовательностями ДНК размером 24 ---- , проявляющими значительную гомологию
у всех изученных Ti- и Ri-плазмид. Границы тДНК гомологичны области oriT конъюгативных плазмид. В этой
области сайт-специфические эндонуклеазы производят одноцепочечный разрыв,
служащий началом репликации по типу разматывающегося рулона, происходящей в
процессе транспорта плазмиды. Репликация обеспечивает сохранение плазмиды в
материнской клетке и появление ее копии в дочерней.
Для нормального процессинга тДНК и ее переноса в
растительную клетку особенно важна ее правая граница, которая одна может
определять полярность переноса тДНК. Удаление правой границы из Ti-плазмид
делает агробактерии полностью авирулентными. Замена ее на искусственно
синтезированную, так же как и на левую, восстанавливает вирулентность
микроорганизма.
На процессинг тДНК в клетках бактерий влияют мутации в
генах vir D, vir C и vir
E – оперонов, на транспорт т-комплекса в растительную клетку – мутации в генах
vir B и vir D – оперонов.
1.1.2. Создание векторов на основе Ti-плазмид
В начале
восьмидесятых годов были сделаны первые попытки перенести чужеродные
последовательности ДНК в растительные клетки либо с помощью транспозонного
мутагенеза [Uernals-teens
et al., 1980],
либо путем сайт-специфической миграции генов в тДНК и последующей двойной
рекомбинацией с Ti-плазмидой дикого типа [Matrke et al., 1981; leemans et al., 1981]. Однако, эти ранние
эксперименты, основанные на двойной рекомбинации, занимали много времени, были
довольно сложны и трансформации проходили с очень низкой частотой. Необходимо
было разработать более эффективные векторы, чтобы облегчить генетические
манипуляции с бактериями и позволить селекцию и регенерацию трансформатов.
Сейчас используют
две принципиально разные системы для введения чужеродных генов в растения с
помощью Ti-плазмид:
1.
----
векторы
2.
бинарные
векторы.
В основе создания
-------- векторов лежит тот факт, что гены тДНК не ------- для растительных
клеток, и любая последовтельность ДНК, встроенная между границами тДНК, может
интегрировать в хромосому растительной клетки и нормально там экспрессироваться
[Zambryski et al., 1983]. В -------- векторых
системах тДНК можно заменить, например, на последовательность pBR322, а чужеродную ДНК, которую
предполагается перенести в растения, нужно проклонировать в этом же векторе.
Затем путем
гомологичной рекомбинации эта чужеродная ДНК может быть перенесена на
Ti-плазмиду реципиентного штамма агробактерии (рис. 2). Одним из первых таких
векторов на основании Ti-плазмид авляется pGV3850 [Zambryski et al., 1983]. В нем все гены, ответственные за
синтез фитогормонов, были заменены на последовательность pBR322.
ДНК pBR322 обеспечивала
гомологию для ------- области тДНК pGV3850 с любыми производыми pBR, несущими клонированный ген.
Гены, кодирующие
различные маркерные белки для быстрого отбора трансгенных растений, были
встроены в pGV3850 [De
Blocle, 1984].
Была разработана система трехродительного скрещивания для переноса любых
производных pBR322 из E.
coli в A.
tumefaciens pGV3850 [Van
Haute et al., 1983]. В настоящее время сконструированы и успешно используются и другие ---
---------- векторы на основе Ti-плазмид [Royers et al., 1988].
Рис. 2.
Схемы --------
(А) и бинарной (Б) векторных систем. vir – область вирулентности. HOM – области гомологии, в пределах которых может происходить
рекомбинация, приводящая к образованию коинтегратов. LB и RB – левая и правая границы
тДНК. MCS - ----- сайт для клонирования. РТМ – маркет трансформации для
растений. RES –
маркер устойчивости к антибиотику для бактерий. OriT – начало переноса и bom-сайт для мобилизации векторов при конъюгации. Col E1 – начало репликации из плазмиды Col E1. RK2 – начало репликации из плазмиды
широкого круга хозяев RK2.
Система бинарных векторов
основана на том, что область тДНК и гены vir могут распологаться на разных
плазмидах [Hockemu et
al., 1983]. В
таких системах обычно присутствуют два элемента:
1) Ti-плазмида-помощник, в
которой тДНК польностью делетирована. Эта плазмида несет в своем составе гены vir, действующие in trans.
2) Плазмида широкого круга
хозяев, имеющая сайты для клонирования и маркерные гены для селекции растений,
ограниченные правой и левой фланкирующими последовательностями тДНК [An et al., 1988] рис
Обе описанные
выше системы векторов предполагают --------- этапах сборку нужных конструкций в
промежуточных векторах, например в pAP2034 [Veltena, Sehell., 1987] или pRT103 [Topter et al., 1983] а затем перенос из в готовом виде в
рецепиентные штаммы агробактерий.
1.1.3. Процессинг тДНК в бактериальной клетке
и ее перенос в клетки растений
Формы
процессированной тДНК. При культивировании Agrobacterium tumefaciens с
механически поврежденными частями растений, регенерирующими протопластами или в
присутствии --------- из клеток бактерий можно выделить различные молекулярные
формы процессированной тДНК – одноцепочечные линейные, двуцепочечные линейные и
двуцепочечные кольцевые, которые могут претендовать на роль посредника в
переносе генетического материала в растительную клетку [-------, 1980]. Причем кольцевая форма,
образующаяся за счет гомологичной рекомбинации между правой и левой границей
тДНК с образованием одной гибридной границы, встречается в очень малых
количествах. При ее образовании не происходит репликативного синтеза ДНК, в то
время как в случае образования двух других форм, возможно прохождение
репликации тДНК в бактериах в процессе ее транспотра в растения (к появлению
одноцепочечных форм может приводить прерывание, ингибирование прерывистого
синтеза запаздывающей цепи). Репликация призвана обеспечить сохранение тДНК в
исходной Ti-плазмиде, если только не допустить возможность существования физического
вырезания материала тДНК из Ti-плазмид за счет образования двухцепочечных
разрывов в границах. Исчезновение тДНК из Ti-плазмид является главным
недостатком отошедшей на второй план подобной "эксцезионной модели".
Тем не менее, образование двуцепочечных разрывов внутри границ и появление
детектируемых количеств линейной двуцепочечной формы тДНК при культивировании
бактериальных клеток в присутствии ---------- исследователи наблюдали уже через
30 минут после добавления этого индуктора в среду. Так же в условиях индукции vir-генов --------- в клетках
агробактерий обнаруживается линейная одноцепочечная форма процессированной тДНК
[Stachel et al., 1986].
Страницы: 1, 2
|