Принципы биохимических исследований 
Электрофорез с иммунофиксацией (JFE) - это двухступенчатый
процесс, использующий электрофорез протеинов на первом этапе и
иммунопреципитацию на втором. При этом исследованию может быть подвергнута
сыворотка крови, моча, спинномозговая или другая жидкость организма. Электрофорез
с иммунофиксацией - один из современнейших методов в кинической лаборатории для
получения характеристик моноклональных иммуноглобулинов. Моноклональная
гаммопатия характеризуется неконтролируемой пролифирацией одного клона
плазменных клеток за счет других клеток. Эта дисфункция часто приводит к
синтезу большого количества одного иммуноглобулина или его субъединицы со
снижением нормальных уровней иммуноглобулинов. При этом на электрофореграмме
выявляется один резко увеличенный пик в бета-гамма-области.
Перекрестный иммуноэлектрофорез.
Информацию о равновесных процессах в р-ре получают при
изучении зависимости скорости миграции ионов исследуемого элемента от
концентрации одного или неск. участвующих в р-ции в-в. По этой зависимости
можно выявлять состав продуктов р-ции и определять константы равновесия. В
случае р-ций комплексообразования изучаемый металл М может находиться
одновременно в неск. ионных формах связи с лигандом А, между к-рыми
устанавливается подвижное равновесие. В такой системе общее, или суммарное,
перемещение в электрич. поле всех ионов, содержащих М и имеющих индивидуальные
подвижности иi, происходит с нек-рой ср. скоростью ис,
характеризующей суммарный электромиграц. перенос металла в единицу времени:
где i - число лигандов в комплексе;
- доля металла, связанного в i-ую ионную форму;
- полная константа устойчивости ионной формы; [М], [А] и [МАi]
- соотв. равновесные концентрации металла, лиганда и комплекса.
Кривая электромиграции (рис.1), отражающая смещение
подвижного равновесия между разл. ионными формами при изменении равновесной
концентрации лиганда, устанавливает области существования: своб. ионов (I); координационно
ненасыщенных форм (II); координационно насыщенных комплексных ионов (III).
Состав комплексных ионов можно определять неск. приемами: по
эмпи-рич. зависимости между подвижностью ионов и величиной их заряда; из
соотношения общей и равновесной концентраций лиганда, к-рое определяется по
скорости электромиграции введенного в систему вспомогат. металла (по ур-нию 2);
по соотношению между коэф. диффузии и подвижностью при одной и той же
концентрации лиганда.
Константы устойчивости ионных форм рассчитывают путем
решения системы из п ур-ний вида (2), где п равно числу ионных
форм.
ИЗОТОПНЫЕ ИНДИКАТОРЫ, в-ва, имеющие в своем составе хим. элемент
с изотопным составом, отличающимся от природного. Часто И. и. называют сами
изотопы-метки, добавляемые в в-во, содержащее прир. смесь изотопов данного
элемента. Т.к. поведение изотопов одного элемента в физ. - хим. процессах
практически идентично (за исключением легких элементов с атомными номерами Z =
10-12, для которых относительно большую роль могут играть изотопные эффекты),
использование И. и. позволяет по регистрации изотопа-метки исследовать
самодиффузию и миграцию меченого в-ва, определять ничтожно малые кол-ва в-ва,
изучать механизмы хим. р-ций и биол. процессов (т. наз. метод изотопных
индикаторов, ранее наз. методом меченых атомов).
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ, метод исследования и анализа в-в,
основанный на измерении спектров поглощения в оптич. области электромагн. излучения.
Иногда под С. понимают раздел физики, объединяющий спектроскопию (как науку о
спектрах электромагн. излучения), фотометрию и спектрометрию [как теорию и
практику измерения соотв. интенсивности и длины волны (или частоты) электромагн.
излучения] ; на практике С. часто отождествляют с оптич. спектроскопией. По
типам изучаемых систем С. обычно делят на молекулярную и атомную. Различают С. в
ИК, видимой и УФ областях спектра (см. Инфракрасная спектроскопия,
Ультрафиолетовая спектроскопия).
Применение С. в УФ и видимой областях спектра основано на
поглощении электромагн. излучения соединениями, содержащими хромофорные (напр.,
С = С, С=С, С=О) и ауксохромные (ОСН3, ОН, NH2 и др.) группы (см. Цветность органических
соединений}. Поглощение излучения в этих областях связано с возбуждением
электронов s-, p-и n-орбиталей осн. состояния и переходами молекул в
возбужденные состояния: s: s*, n:
s*, p:
p* и n: p* (переходы перечислены в порядке уменьшения энергии,
необходимой для их осуществления; см. также Молекулярные спектры). Переходы
s: s*
находятся в далекой УФ области, напр. у парафинов при ~ 120 нм. Переходы n:
s* наблюдаются в УФ области; напр., орг.
соед., содержащие n-электроны, локализованные на орбиталях атомов О, N, Hal, S, имеют Полосы поглощения при длине
волны ок. 200 нм. Линии, соответствующие переходам p: p*, напр., в спектрах
гетероциклич. соединений проявляются в области ок.250-300 нм и имеют большую
интенсивность. Полосы поглощения, соответствующие переходам n: p*, находятся в ближней УФ и видимой областях
спектра; они характерны для соед., в молекулах к-рых имеются такие хромофорные
группы, как С = О, C = S, N = N. Так, насыщ. альдегиды и кетоны имеют максимумы
поглощения при длине волны ок.285 нм. Переходы типа n: p* часто оказываются запрещенными, и соответствующие
полосы поглощения обладают очень малой интенсивностью.
Переходы типа p: p* могут сопровождаться переходом электрона с
орбитали, локализованной гл. обр. на одной группе (напр., С=С), на орбиталь,
локализованную на др. группе (напр., С=О). Такие переходы сопровождаются
переносом электрона с одного атома на другой и соответствующие спектры наз. спектрами
с переносом заряда. Последние характерны для разл. комплексов (напр., арома-тич.
соединений с галогенами), интенсивно поглощающих в видимой и УФ областях.
Для ионов переходных металлов и их комплексных соед. характерны
переходы с участием d-электронов, а для РЗЭ и актиноидов-переходы с
участием f-электронов. Соответствующие соед. в р-ре бывают интенсивно
окрашенными, причем окраска (спектр поглощения) зависит от степени окисления
катиона и устойчивости комплексного соединения. Поэтому С. широко используют
при исследовании и анализе комплексных соед. металлов.
Изолированные, не взаимодействующие между собой хромофоры в
молекуле поглощают независимо. В случае к. - л. взаимод. между ними
аддитивность спектров нарушается. По отклонениям от аддитивности можно судить о
характере и величине взаимодействия. Поскольку положение полос в спектре
определяется как разность энергий основного и возбужденного состояний молекул,
можно определять структуру энергетич. уровней молекул или по известной схеме
энергетич. уровней определять положение полос поглощения. Любому электронному
состоянию молекул соответствует набор разл. колебат. уровней энергии. Колебат. структура
полосы, соответствующей переходу между электронными уровнями, может отчетливо
проявляться не только в спектрах газов, но и в спектрах нек-рых р-ров, что дает
возможность получать дополнит. информацию о взаимод. молекул. Спектрофотометрич.
исследование спектров молекул в видимой и УФ областях позволяет установить вид
электронных переходов и структуру молекул. При этом часто исследуют влияние
разл. типов замещения в молекулах, изменения р-рителей, т-ры и др. физ. - хим. факторов.
В ИК области проявляются переходы между колебат. и вращат. уровнями
(см. Колебательные спектры, Вращательные спектры). Среди частот
колебаний молекул выделяют т. наз. характеристические, к-рые практически
постоянны по величине и всегда проявляются в спектрах хим. соед., содержащих
определенные функц. группы (вследствие чего эти частоты иногда называют
групповыми; см. табл. на форзаце 2-го тома). Теория колебаний сложных молекул
позволяет расчетным путем предсказать колебат. спектр соединений, т.е. определить
частоты и интенсивности полос поглощения.
Колебат. спектры молекул чувствительны не только к изменению
состава и структуры (т.е. симметрии) молекул, но и к изменению разл. физ. и хим.
факторов, напр. изменению агрегатного состояния в-ва, т-ры, природы р-рителя,
концентрации исследуемого в-ва в р-ре, разл. взаимод. между молекулами в-ва (ассоциация,
полимеризация, образование водородной связи, комплексных соед., адсорбция и т.п.).
Поэтому ИК спектры широко используют для исследования, качеств. и количеств. анализа
разнообразных в-в.
В ближней ИК области (10000-4000 см-1, или 1-2,5
мкм), где расположены обертоны и составные частоты осн. колебаний молекул,
полосы поглощения имеют интенсивность в 102-103 раз
меньше, чем в средней ИК области (4000-200 см-1). Это упрощает
подготовку образцов, т.к толщина поглощающего слоя м. б. достаточно большой (до
неск. мм и более). Эксперим. техника для работы в этой области относительно
проста. Однако чувствительность и селективность определения отдельных соед. невелики.
Тем не менее высокое отношение сигнал: шум (до 105) создает хорошие
условия для количеств. анализа при содержании определяемого соед. ок.1% и выше.
Подобные анализы выполняются за 1 мин. В дальней ИК области (200-5 см-1)
могут наблюдаться чисто вращат переходы.
Интенсивность полосы поглощения молекулы определяется
вероятностью соответствующего электронного (или колебательного) перехода. Для
характеристики интенсивности полосы служит молярный коэф. поглощения e (см. Абсорбционная спектроскопия),
определяемый, согласно закону Бугера-Ламберта-Бера, как e = A/Cl, где А = = - lgT= -
lg (I/I0), T-пропускание, I0
и I-интенсивности соотв. падающего и прошедшего через в-во излучения, С-молярная
концентрация в-ва, поглощающего излучение, l-толщина поглощающего слоя (кюветы),
в см. Обычно e<105, в ИК
области e<2·103 (л/моль·см).
Закон Бугера-Ламберта-Бера лежит в основе количеств. анализа по спектрам
поглощения.
Для измерения спектров используют спектральные
приборы-спектрофотометры, осн. части к-рого: источник излучения, диспергирующий
элемент, кювета с исследуемым в-вом, регистрирующее устройство. В качестве
источников излучения применяют дейтериевую (или водородную) лампу (в УФ области)
и вольфрамовую лампу накаливания или галогенную лампу (в видимой и ближней ИК
областях). Приемниками излучения служат фотоэлектронные умножители (ФЭУ) и
фотоэлементы (фоторезисторы на основе PbS). Диспергирующими элементами прибора
являются призмен-ный монохроматор или монохроматор с дифракц. решетками. Спектр
получают в графич. форме, а в приборах со встроенной мини-ЭВМ-в графической и
цифровой формах. Графически спектр регистрируют в координатах: длина волны (нм)
и (или) волновое число (см-1) - пропускание (%) и (или) оптич. плотность.
Осн. характеристики спектрофотометров: точность определения длины волны
излучения и величины пропускания, разрешающая способность и светосила, время
сканирования спектра. Мини-ЭВМ (или микропроцессоры) осуществляют автоматизир. управление
прибором и разл. мат. обработку получаемых эксперим. данных: статистич. обработку
результатов измерений, логарифмирование величины пропускания, многократное
дифференцирование спектра, интегрирование спектра по разл. программам,
разделение перекрывающихся полос, расчет концентраций отдельных компонентов и т.п.
Спектрофотометры обычно снабжаются набором приставок для получения спектров
отражения, работы с образцами при низких и высоких т-рах, для измерения
характеристик источников и приемников излучения и т.п.
Для исследования спектров в ИК области используют обычно
спектрофотометры, работающие в интервале от 1,0 до 50 мкм (от 10000 до 200 см-1).
Осн. источниками излучения в них являются стержень из кароида кремния (глобар),
штифт из смеси оксидов циркония, тория и иттрия (штифт Нернста) и спираль из
нихрома. Приемниками излучения служат термопары (термоэлементы), болометры,
разл. модели оптико-акустич. приборов и пироэлектрич. детекторы, напр. на
основе дейтерированного триглицинсульфата (ТГС). В спектрофотометрах,
сконструированных по "клас-сич." схеме, в качестве диспергирующих
элементов применяют призменный монохроматор или монохроматор с дифракц. решетками.
С кон.60-х гг.20 в. выпускаются ИК фурье-спектрофотометры (см. Фурье-спектроскопия),
к-рые обладают уникальными характеристиками: разрешающая способность-до
0,001 см-1, точность определения волнового числа v-до 10-4 см-1
(относит. точность bDv/v!! 10 - 8),
время сканирования спектра может достигать 1 с, отношение сигнал: шум превышает
105. Эти приборы позволяют изучать образцы массой менее 1 нг. К ним
также имеются разл. приставки для получения спектров отражения, исследования
газов при малых или высоких давлениях, разных т-рах и т.п. Встроенная в прибор
мини-ЭВМ управляет прибором, выполняет фурье-преобразования, осуществляет
накопление спектров, проводит разл. обработку получаемой информации.
Наиб. распространение получил анализ, основанный на
фотолюминесценции исследуемого в-ва, возбуждаемой УФ излучением. Источниками
последнего служат кварцевые газоразрядные ртутные или ксеноновые лампы и УФ
лазеры. Pегистрируют люминесценцию визуально, фотографически или
фотоэлектрически с помощью спектрографов, фотометров и спектрофотометров Л. а. подразделяют
на качественный и количественный. Качеств Л. а. проводят по спектрам люминесценции.
Его используют, напр., для обнаружения битумов в породах, следов
люминесцирующих орг. и неорг. в-в в разл. объектах. Разновидность качеств. Л. а.
- сортовой анализ, к-рый позволяет обнаруживать невидимые при обычном освещении
различия в исследуемых объектах и используется для установления сортности и
качества стекол, семян, с. - х. продукции, для определения минералов в породах,
поверхностных и сквозных дефектов, выявления подделок, в криминалистике и т.д. Количеств
Л. а. основан на зависимости интенсивности люминесценции от кол-ва
люминесцирующего в-ва. Различают флуоресцентный, фосфоресцентный и
хемилюминесцентный анализы. Флуоресцентный анализ основан на образовании
люминесцирующих комплексных соед. элементов с орг. реагентами, напр. гидроксипроизводными
флавона (морин, кверцетин), производными тригидроксифлуорона и
гидроксиантрахинона, 8-оксихинолином, родаминами и др. Этот метод мало
селективен, большинство реагентов - групповые, лишь люмогаллион специфичен для
определения Ga и люмомагнезон - Mg. Для увеличения селективности используют
экстракционно-флуоресцентный анализ - предварит. разделение анализируемой смеси
методом экстракции, а также охлаждение р-ров до азотных и гелиевых т-р. В
последнем случае может возникнуть фосфоресценция. Фосфоресцентный анализ
обладает большой селективностью, т.к лишь немногие катионы образуют с орг. реагентами
фосфоресцирующие комплексы, сами же реагенты не фосфоресцируют.д.ля регистрации
спектров и интенсивности фосфоресценции используют фосфороскоп; при этом
флуоресценция не регистрируется. Хемилюминесцентный анализ основан на свечении,
возникающем в результате окислит. - восстановит. р-ций орг. в-в, напр. люминола,
люцигенина и др., с катионами переходных металлов, напр. Fe (III), Co (II),
Cu (II), Ni (II), Mn (II) и др.; концентрацию последних определяют по изменению
интенсивности свечения. Предел обнаружения 5.10-7%. По собственной
люминесценции определяют U, лантаноиды и нек-рые переходные элементы с большой
селективностью, т.к их спектры в ряде случаев характеризуются структурой. Пределы
обнаружения U в водах и геол. объектах при применении кристаллофосфоров 5.10-7
- 1.10-8%; РЗЭ при использовании орг. реагентов 103 - 10-4%,
в кристаллофосфорах 10-5-10-6%; переходных элементов (в т.
ч. и платиновых) в кристаллофосфорах 10-5-10-6%. Ртутеподобные
ионы (Tl+, Pb2+, Bi3+, Те4+, As3+,
Sb3+) можно определять по люминесценции замороженных р-ров их солей
или в кристаллофосфорах с пределом обнаружения 10-4-10-7%.
Применение лазеров позволяет снизить пределы обнаружения нек-рых элементов до
10-13%.Л. а. орг. соед. затруднен, т.к их спектры люминесценции, как
правило, неспецифичны. Однако предложены методы количеств. определения
порфиринов, витаминов, антибиотиков, хлорофилла и др. в-в, в спектрах к-рых
имеются характеристичные полосы. При использовании лазеров пределы обнаружения
достигают 10-7-10-11%. Ароматич. соед. в замороженных
р-рах алифатич. углеводородов при т-рах 77 К дают характерные для каждого соед.
квазилинейчатые спектры люминесценции (эффект Шпольского). Этот метод
используют для определения полициклич. ароматич. углеводородов в экстрактах
растений, почв, продуктов питания, горных пород и т.д. с пределом обнаружения
10-7-10-8%, а также для определения бензола, его
гомологов и производных, ароматич. аминокислот при т-рах жидкого воздуха,
азота, гелия в водно-солевой матрице с пределом обнаружения 10-4-10-6%.Л.
а. используют в иммунохим. анализе для определения антител, гормонов, лек. препаратов,
вирусных и бактериальных антигенов по концентрации комплекса антиген - антитело.
При этом в иммунном флуоресцентном анализе к антителу непосредственно
присоединяют флуоресцирующие в-ва, напр. РЗЭ, флуоресцирующие красители (чувствительность
метода 10-14 моль/л), а в иммуноферментном анализе к антителу
присоединяют фермент и в результате ферментативной р-ции, сопровождаемой
биолюминесценцией, определяют ферментативную активность.
Метод анализа в-ва путем определения массы (чаще, отношения
массы к заряду m/z) и относит. кол-ва ионов, получаемых при ионизации
исследуемого в-ва или уже присутствующих в изучаемой смеси. Совокупность
значений m/z и относит. величин токов этих ионов, представленная в виде графика
или таблицы, наз. масс-спектром в-ва (рис.1).
Начало развитию М. - с. положено опытами Дж. Томсона (1910),
исследовавшего пучки заряженных частиц, разделение к-рых по массам
производилось с помощью электрич. и магн. полей, а спектр регистрировался на
фотопластинки. Первый масс-спектрометр построен А. Демпстером в 1918, а первый
масс-спектрограф создал Ф. Астон в 1919; он же исследовал изотопич. состав
большого числа элементов. Первый серийный масс-спектрометр создан А. Ниром в
1940; его работы положили начало изотопной М. - с. Прямое соединение
масс-спектрометра с газо-жидкостным хроматографом (1959) дало возможность
анализировать сложные смеси летучих соед., а соединение с жидкостным
хроматографом с помощью термораспылит. устройства (1983) - смеси труднолетучих
соединений. Macс-спектральные приборы. Для разделения ионов исследуемого в-ва
по величинам m/z, измерения этих величин и токов разделенных ионов используют
масс-спектральные приборы. Приборы, в к-рых регистрация осуществляется электрич.
методами, наз. масс-спектрометрами, а приборы с регистрацией ионов на
фотопластинках - масс-спектрографами. Масс-спектральные приборы состоят из
системы ввода пробы (система напуска), ионного источника, разделительного
устройства (масс-анализатора), детектора (приемника ионов), вакуумных насосов,
обеспечивающих достаточно глубокий вакуум во всей вакуумной системе прибора, и
системы управления и обработки данных (рис.2). Иногда приборы соединяют с ЭВМ:
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5
|
|
