Получение рекомбинантного аденовируса CELO

поверхность нуклеосомы и фиксируется межнуклеосомными контактами. «Хвост» гистона Н4 имеет много контактов с поверхностью димера Н2А - Н2В соседней нуклеосомы. «Хвосты» гистонов выходят на поверхность хроматиновой фибриллы, участвуют в межнуклеосомном взаимодействии, очень подвижны и подвергаются многочисленным модификациям: ацетилированию, фосфорилированию, метилированию, убиквитинилированию и АДФ-рибозилированию. Эти модификации приводят к изменению заряда, гидрофобности и других свойств поверхности белковых глобул. В результате формируется сложная матрица для узнавания её другими регуляторными белками и внешними сигналами. Поскольку концевые домены гистонов участвуют и в межнуклеосомном взаимодействии, вышеперечисленные модификации влияют и на характер упаковки хроматиновой фибриллы, разрыхляя или, наоборот, уплотняя её, что, в свою очередь облегчает или затрудняет доступ к ДНК многочисленным регуляторным факторам.

Эти свойства «хвостов» гистонов в структуре нуклеосомы имеют большое значение для расшифровки и понимания механизмов функционирования хроматина, его поведения при активации генов, репрессии их и многих других процессов, связанных с доступом к ДНК /4/.

1.2.4  Характеристика «гистонового кода»

Наиболее разработанной в настоящее время моделью функционирования хроматина считается «гистоновый код». Это - разнообразный набор модификаций гистоиовых «хвостов» на поверхности нуклеосом, который можно целенаправленно менять и передавать по наследству. Он и определяет функциональное состояние гена.

«Гистоновый код», по-видимому, является основным эпигенетическим механизмом, контролирующим включение или выключение генов и передачу программы этого контроля по наследству от клетки к клетке.

«Гистоновый код» оказался идеальным эпигенетическим механизмом, с помощью которого можно писать программу каскадного включения - выключения генов при развитии, не затрагивая информацию о белках, записанную на самой ДНК.

Гипотеза «гистонового кода» предполагает, что маркировки на модифицированных концевых заменах гистонов должны узнаваться регуляторными белками. Первым был обнаружен так называемый бромодомен, который специфически узнает ацетилированные лизины на гистоновых «хвостах». Бромодомен присутствует во многих регуляторах транскрипции генов (например, белок TAFn250). (Субъединица базального транскипционного фактора TFIID) узнаёт, например, комбинацию нескольких ацетильных групп и имеет две последовательно расположенные копии бромодомена, каждая их которых узнаёт свою ацетильную группу.

Другой белковый домен, узнающий маркировки на гистоновых «хвостах», называется хромодоменом. Из несущих хромодомен белков лучше всего изучен НР1 (от англ. Heterochromatin protein). Этот белок принимает участие в структурной организации гетерохроматина - области хроматина, находящейся в высококонденсированном состоянии, где все гены репрессированы. Таким образом, белок НР1 - это маркёр неактивного состояния хроматина. Он имеет высокое сродство к метилированному 9-му лизину (Tys-9) гистона НЗ. Связываясь с метилированным Tys-9 НЗ в одной нуклеосоме, белок HP 1 в свою очередь, метилирует соседние нуклеосомы, что вызывает распознание области метилирования хроматина. Этим достигается эффект высококонденсированного состояния на протяжённых участках хроматина. В настоящее время ведётся поиск доменов, узнающих другие модификации «хвостов» гистонов (фосфорилирование, убиквитинилирование и АДФ-рибозилирование).

Существуют несколько вариантов реализации «гистонового кода».

Согласно одному из них, модификации гистоновых «хвостов», участвующих в межнуклеосомных взаимодействиях, изменяют их суммарный заряд, за счёт чего уменьшается степень компактизации хроматиновой фибриллы, и ДНК становится доступной для регуляторных белков. В этом случае роль ферментов, модифицирующих «хвосты» гистонов, заключается только в увеличении зоны модификаций, и как следствие - усиление эффекта компактизации либо декомпактизации.

Другой механизм изменения статуса гена, маркированного определёнными сигналами по «хвостам» гистонов, связан с факторами перестройки хроматина. В 1992 году на дрожжах впервые было показано, что в присутствии АТФ определенные белковые комплексы обладали способностью изменять структуру хроматина, удаляя или сдвигая нуклеосомы с регуляторных участков ДНК. При этом активировались молчащие гены. В состав такого комплекса входят белки, несущие бромодомены, хромодомены, избирательно узнающие модифицированные «хвосты» гистонов. Это позволяет целенаправленно доставлять комплекс к регуляторному участку гена, где и происходят структурные изменения в хроматине, облегчающие доступ к ДНК белкам, активирующим транскрипцию этого гена.

Получены данные, свидетельствующие, что белки, узнающие «гистоновый код», выполняют транспортную функцию: доставляют к необходимым генам комплекс регуляторных белков, порождающих целый каскад биохимических реакций в области хроматина, который соответствует регуляторному участку гена. В состав комплекса могут входить как модифицирующие белки, так и транскрипционные факторы.

Изучение эпигенетических механизмов уже перестало быть только проблемой фундаментальной науки. Известно, что уровень и характер метилирования ДНК отклоняется от нормы при канцерогенезе и старении. Понимание того, что метилирование ДНК определяется эпигенетическим молчанием хроматина, проливает свет на механизмы этих процессов. Расшифровка специфического эпигенетического «ракового кода» и «кода старения» на уровне метилирования ДНК имеет огромное практическое значение. Итак, сделаем вывод: многочисленные модификации гистоновых «хвостов», экспонированные на поверхности хроматиновой фибриллы, и их комбинации, огромный набор специализированных ферментов, узнающих эти комбинации, позволяют записать очень сложную программу последовательности включения - выключение генов. В этом случае генетической информации, записанной на ДНК, оказывается недостаточно для получения полноценного организма. К информации должна прилагаться инструкция по её использованию. Подтверждением вышесказанного могут служить огромные сложности при получении клонов животных. Если берётся ДНК из клетки любого органа и переносится в яйцеклетку, где всё подготовлено к тому, чтобы дать развитие новому организму, то выясняется, что эпигенетические механизмы развития в исходной клетке давно запущены, стереть эту информацию невозможно и многие гены уже никогда не смогут начать работать. Несмотря на то, что имеется полная генетическая копия, то есть геном представлен абсолютно такой же ДНК, как запустить программу развития, клетка не знает. Этой информацией обладают только ДНК половых клеток и так называемых эмбриональных стволовых клеток - первые деления оплодотворённой яйцеклетки. Только на этой стадии эпигенетические механизмы ещё не включены, и клетка может стать и клеткой печени, и клеткой мозга, и клеткой кожи. На начальных этапах исследования ДНК казалось, что, расшифровав полную генетическую информацию геномной ДНК, появится возможность управлять внутриклеточными процессами. Однако выясняется, что важна и эпигенетическая информация, язык которой гораздо сложнее и от полной расшифровки которой наука ещё очень далека. 1.3. Современные методы ДНК-технологии.

1.3.1 Содержание генетической инженерии

В предыдущих разделах описывались генетические и эпигенетические механизмы наследственности. Современные методики позволяют модифицировать наследственную информацию и конструировать организмы с заданными наследственными свойствами. Эти методы составляют предмет генетической инженерии.

Генетическая инженерия - это искусство использования знаний, методов и техники физико-химической биологии и молекулярной генетики для конструирования организмов с заданными наследственными свойствами. Конечная цель состоит в получение рекомбинантной ДНК с последующим включением её в реципиентную клетку или в осуществлении переноса целых хромосом от клеток-доноров в клетки-реципиентов. В основу генно- инженерных методов заложена способность ферментов (рестриктаз) расщеплять ДНК на отдельные нуклеотидные последовательности, которые могут быть использованы для встраивания их в геномы бактериальных плазмид и фагов с целью получения гибридных форм, состоящих из собственной ДНК и дополнительных встроенных фрагментов несвойственной им ДНК. Таким способом добиваются клонирования генов, когда выделяют нужный отрезок ДНК из какого-либо биообъекта и затем получают любое количество его, выращивая колонии генетически идентичных клеток, содержащих заданный участок ДНК. Другими словами, клонирование ДНК—это получение её генетически идентичных копий.

Генетическую инженерию подразделяют на генную инженерию, геномную инженерию, и хромосомную инженерию. Сущность первой состоит в целенаправленном использовании перестроек естественного генома, осуществляемых in vivo или in vitro, для изменения генетических характеристик известных вирусов и клеток. Примером генной инженерии in vitro является создание молекулярных химер из фрагментов ДНК разного происхождения, включения их в реципиентные клетки Е. coli, Вас. subtilis и др., с последующим культивированием этих организмов в целях получения необходимых белковых продуктов (пептидных гормонов, ферментов и т.д.)

Сущность геномной инженерии заключается в целенаправленной глубокой перестройке генома прокариот или эукариот вплоть до создания новых видов. При геномной инженерии добиваются внесения большого количества дополнительной генетической информации и в результате получают гибридный организм, отличающийся от исходного по ряду признаков.

В случае переноса изолированных хромосом от клетки-донора одного организма в клетку-реципиент другого организма, говорят о хромосомной инженерии. Благодаря хромосомной инженерии стали возможными получение высокомолекулярных БАВ, присущих человеку, лечение наследственных заболеваний, селекция пород домашних животных и различных видов растений.

1.3.2  Методы исследования структуры и функции гена

Образование новых сочетаний генов и их частей в природных условиях, по-видимому, не носит целенаправленного характера, и лишь жесткая проверка естественным отбором может оценить жизненную значимость таких преобразований геномов. Однако сознательное использование в лабораторных условиях основных генетических принципов, лежащих в основе природных перемещений генов, позволило разработать более эффективные системы передачи генетической информации между организмами и приступить к беспрецедентным по информативности исследованиям генетических явлений на молекулярном уровне.

Необходимость манипулирования генами диктуется конкретными задачами фундаментальных и прикладных исследований. Для понимания молекулярных механизмов функционирования отдельных генов и взаимосвязанных генетических систем большое значение имеет работа с изолированными генами. Такие исследования позволяют определить границы генов, выделить их в чистом виде и идентифицировать элементы структуры, существенные для функционирования. Доказательством функциональной значимости выделенного участка генома может быть только его нормальная экспрессия в модельной генетической системе. Поэтому следующим этапом исследования выделейного гена всегда является перемещение его в такую генетическую систему, где экспрессия гена легко обнаруживается. Результаты экспрессии оценивают либо по появлению белкового продукта, кодируемого исследуемым геном, либо по изменению функций биологической системы вследствие появления в ней новой ферментативной или другой активности, например по компенсации присутствующей в этой системе мутации. Таким образом, в результате исследования структуры конкретного гена и моделирования его экспрессии в искусственной генетической системе можно понять особенности его функционирования в живом организме. Подобный подход может быть успешно применен как к известным генам, которые выделяются целенаправленно, так и к неидентифицированным ранее последовательностям нуклеотидов, функциональную значимость которых определяют лишь после выделения их в чистом виде. Последний подход реализуется в так называемой обратной генетике.

В настоящее время с помощью методов генной инженерии получены данные о структуре и функционировании генов разнообразных организмов, что дало возможность перейти на качественно новый уровень генетических исследований. Это, во-первых, возможность переноса генова в ное для него генетическое окружение с дальнейшей его экспрессией, что ведет к изменению свойств организма, в геном которого вводится ген (например создание продуцентов биологически активных веществ или трансгенных животных), а также осуществление генотерапии наследственных и приобретенных заболеваний путем искусственного замещения мутантных аллелей. Во-вторых, стало реальным конструирование новых генов путем объединения in vitro как известных, так и новых, искусственно синтезированных последовательностей нуклеотидов. Этот подход используется в белковой инженерии для исследования функциональной значимости отдельных аминокислот и доменов в полипептидных цепях ферментов, а также для создания новых белков. В- третьих, в современной биотехнологии появилась возможность применять изолированные гены в составе генно-инженерных конструкций для получения пищевых продуктов и биологически активных веществ белковой природы

1.3.3 Предмет рекомбинантной ДНК-биотехнологии

Практическое использование рекомбинантных ДНК различного происхождения составляет основу рекомбинантной ДНК-биотехнологии, или сокращенно рДНК-биотехнологии.

Сущность рДНК-биотехнологии заключается в том, что нуклеотидная последовательность, которую необходимо выделить или размножить, ковалентно встраивается в самореплицируюшиеся молекулы нуклеиновой кислоты, называемые векторами. Далее такая последовательность нуклеотидов в составе вектора вводится в клетки про- или эукариотического организма, и эти гибридные клетки в селективных условиях, обеспечивающих сохранение вектора внутри клеток, выращивают на питательной среде. В результате образуется клон клеток, теоретически содержащих идентичные векторные молекулы с одной и той же вставкой чужеродной последовательности нуклеотидов. Поскольку объединение молекул клонируемой последовательности нуклеотидов и вектора является не чем иным, как рекомбинацией in vitro, такие гибридные молекулы называют рекомбинантными молекулами. В настоящее время разработаны многочисленные методы, позволяющие выделять определенные последовательности нуклеотидов из сложной смеси фрагментов хромосомной ДНК, а также осуществлять обмен между строго определенными фрагментами генов и другими последовательностями нуклеиновых кислот. Во всех этих реакциях, как правило, используются высокоочищенные препараты нуклеиновых кислот и ферментов нуклеинового обмена /8/.

рДНК-биотехнологию подразделяют на следующие этапы: получение чужеродной ДНК, разрезание полученной ДНК на фрагменты и их очистка,

включение фрагмента чужеродной ДНК в векторную плазмиду и получение рекомбинантной ДНК, или р-ДНК, введение р-ДНК в клетки-реципиенты и клонирование генов, амплификация и экспрессия р-ДНК.

1.3.4 Получение чужеродной ДНК

Чужеродную ДНК можно получить с помощью химического или ферментативного синтеза, либо из любого организма с последующим определением её первичной структуры.

Синтетически получают гены, в случае известной аминокислотной последовательности белка. Так синтезированы гены, кодирующие образование гормонов: про-инсулин человека, интерферон а и а2.

Изоляция структурного гена из генома клетки возможна только при работе с прокариотами, гены которых не содержат интронов. У эукариот ген состоит не только из участков, где записана структура белка (экзонов), но и участков, которые не кодируют белок (интронов) /9/.

Транскрипция у эукариот происходит в ядре, при этом образуется матричная РНК (м-РНК). При её перемещении из ядра через ядерную мембрану в цитоплазму происходит созревание м-РНК - процессинг, в результате чего интроны вырезаются с помощью специальных ферментов, а экзоны сшиваются (сплайсинг). При работе с эукариотами используют синтез структурного гена путем обратной транскрипции, то есть получение ДНК путём копирования м- РНК. Для получения комплементарной ДНК в качестве матрицы используют зрелую м-РНК, не содержащую интронов

1.3.5 Конструирование рекомбинантных ДНК

Основными инструментами для молекулярного конструирования являются два типа ферментов:

а) рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы), необходимые для получения фрагментов ДНК;

б) лигазы, служащие для сшивания (соединения) участков ДНК.

1.3.5.1  ДНК-рестриктазы и ДНК-метилазы

Это ферменты, впервые открытые как часть системы рестрикции- модификации ДНК у бактерий, специфически гидролизуют молекулы двухцепочечных ДНК при наличии в них определенных последовательностей нуклеотидов, называемых сайтами рестрикции.

По механизму действия и молекулярной структуре различают три типа рестриктаз. Ферменты рестрикции типа I представляют собой сложные мультимерные комплексы, построенные из трех субъединиц с молекулярной массой до 300 кДа, которые обладают рестриктазной, ДНК-метилазной и АТРазной активностями. Рестриктазы типа I для проявления своей активности требуют присутствия АТР, S-аденозилметионина и ионов Mg , они не распознают специфические последовательности нуклеотидов и в силу этого не находят широкого применения в генной инженерии. Рестриктазы типа II узнают специфические последовательности нуклеотидов в точке расщепления ДНК или непосредственной близости от нее, требуют для проявления активности наличия в реакционной смеси АТР и ионов Mg2" и чаще всего используются при молекулярном клонировании. Ферменты типа III объединяют все прочие рестрикционные эндонуклеазы. Они также активны только в присутствии АТР и ионов Mg2 и не проявляют абсолютной зависимости от S-аденозилметионина. Названия рестриктаз складываются из первой буквы родового и двух букв видового названия бактерий, в которых они обнаружены, например Есо - Е. coli. В том случае, когда различные по специфичности действия рестриктазы присутствуют в клетках разных штаммов одного вида бактерий, в название рестриктазы вводят дополнительную букву, например рестриктазы Hinc и Hind выделены из бактериальных клеток Haemophilus influenzae, штаммы с и d. Цифры, следующие за буквенными обозначениями, отражают последовательность открытия соответствующих рестриктаз в клетках бактерий одного вида, например Hael, Haell и НаеШ из Н. aegipticus. Рестриктазы типа II - основной инструмент генной инженерии. Большинство рестриктаз типа II специфически узнают на ДНК тетра- и гексануклеотидные последовательности, а по крайней мере три из них - октануклеотиды. Чем короче олигонуклеотидная последовательность сайта рестрикции, узнаваемого рестриктазой, тем чаще он встречается в случайной последовательности нуклеотидов, в которой каждый из четырех нуклеотидов представлен с одинаковой частотой (50% А-Т-пар и 50% G-C-nap). Так, случайная тетрануклеотидная последовательность встречается в среднем через каждые 256 п.о., а гексануклеотидная - через каждые 4096 п.о. Однако в природных ДНК распределение нуклеотидов может заметно отличаться от случайного. Например, для эукариотических ДНК характерна низкая частота встречаемости динуклеотида CpG и соответственно сайтов рестрикции, содержащих эти динуклеотиды (рестриктазы Hhal, Hpall, TaqI, Thai, Aval, Haell, Hindll, Sail, Smal, Xhol, Xmal). Существенное отклонение частоты встречаемости сайтов рестрикции от ожидаемого при случайном их распределении вдоль ДНК свойственно и хромосомам термофильных бактерий, которым, напротив, свойственно (хотя и не во всех случаях) обогащение по G-C-парам. Для большинства сайтов, узнаваемых рестриктазами типа II, характерно наличие в них симметрии второго порядка, т.е. узнаваемые ими последовательности представляют собой палиндромы, например у рестриктазы EcoRI - 5'-GAATTC- 3'. Это означает, что нуклеотиды, расположенные в каждой из цепей на равном расстоянии от оси симметрии, комплементарны друг другу. Если точки расщепления противоположных цепей ДНК смещены друг относительно друга в сайте рестрикции, то образующиеся в результате рестрикции концы ДНК содержат выступающие одноцепочечные участки. Поскольку такие участки комплементарны сами себе и друг другу и могут между собой взаимодействовать, их часто называют "липкими" концами. В "липких" концах выступающим одноцепочечным участком может быть как 5'-, так и З'-конец Формальным признаком образования 5'- или 3'-выступающих "липких" концов в сайтах рестрикции является расположение точки расщепления цепей ДНК в последовательности, используемой для обозначения сайта рестрикции, слева или справа от оси симметрии соответственно. У некоторых рестриктаз точки расщепления обеих цепей ДНК расположены непосредственно друг под другом в сайте рестрикции. В этом случае после расщепления ДНК "липких" концов не образуется, а получаются так называемые "тупые" концы, в которых нет выступающих одноцепочечных участков ДНК. Имеется одно принципиальное функциональное различие между 5'- и 3'-выступающими "липкими" концами - последние невозможно пометить путем их достройки ДНК-полимеразой. Эту особенность следует иметь в виду при выборе рестриктаз для получения рестрикционных фрагментов ДНК, которые предполагается использовать в качестве зондов.

Страницы: 1, 2, 3