Методы культивирования возбудителя ранней пятнистости и оценки устойчивости растений к заболеванию

Аsc locus - ген с двумя аллелями, когда наблюдается полная доминантность – растения устойчивы к патогену, когда неполная доминантность – восприимчивы к токсину [4].

Гомозигота восприимчивых линий в 1000 раз более чувствительна к ААL-токсинам, чем устойчивые линии, в то время как их гибрид F1 имеет промежуточную чувствительность, являясь в 50 раз более чувствительным, чем гомозигота устойчивых образцов [22].

Эти данные подтверждают, если аsc locus контролирует обе функции. К тому же аsc locus удобен для физиологических исследований функционального генного контролирования взаимодействия патоген – хозяин, используя AAL-токсин как молекулярный маркер, если обе реакции контролируются одинаковым локусом. Совместимые или несовместимые взаимоотношения патоген – хозяин часто обусловлены различием только одного гена. Однако различия в физиологическом состоянии устойчивых и восприимчивых инфицированных растений-хозяев часто обусловлено поддельными биохимическими событиями, которые являются следствием аллельного различия между близко связанными, но не относящимися к болезни локусами [4].

1.3 Системная приобретенная устойчивость

Растения развивают большое количество индуцированных защитных механизмов против патогенов. Распознание патогена вызывает локализованную реакцию сопротивления, известную как сверхчувствительный ответ (HR), который характеризуется быстрой смертью клеток в месте инфекции. В 1960 Росс показал, что растения табака, зараженные вирусом табачной мозаики, впоследствии развивали возрастающую устойчивость к вторичным инфекциям в тканях. Такое распространение устойчивости в пределах тканей растений было названо системная приобретенная устойчивость (SAR) [6].

SAR может быть активирована в любом растении патогенном, который вызывает некроз или как часть HR. Такая устойчивость длительна, и иногда может сохраняться на протяжении всей жизни растения. Молекулярно SAR характеризуется возрастающей экспрессией большого числа связанных с патогенезом генов (PR-гены). PR-белки были впервые описаны в 1970 г. Ван Лунном, который обнаружил накопление различных новых белков после инфицирования табака вирусом TMV [6].

В 1979 г. Уайт обнаружил, что накопление PR белков и устойчивость к TMV можно индуцировать путем обработки растений табака салициловой кислотой (SA), аспирином (ацетил SA), или бензойной кислотой. Доказательства, что SA – это сигнал для индукции SAR поступили также из двух публикаций 1990г. Малами показал, что концентрация эндогенной SA возрастает в тканях растений после инфицирования табака вирусом TMV, и этот рост кореллирует с индукцией PR генов [6].

Необходимость SA в качестве эндогенного сигнала для SAR было показано Гаффнеем, он использовал бактериальный ген nahG, кодирующий салицилат гидроксилазу, которая удаляет SA путем превращения ее в катехоламин. Трансгенный табак, экспрессирующий ген nahG накапливал очень мало SA после атаки патогена и не экспрессировал PR белки. [5, 6]

Растения, которые не реагируют на SA были выделены в мутантные линии, также они несут мутации по одинаковым генам NPR1/NIM1 (NON-EXPRESSER OF PR GENES1/NONINDUCIBLE IMMUNITY1) [6].

1.3.1 Природа системного сигнала

Салициловая кислота

Салициловая кислота – фенольное соединение, важный молекулярный эффектор. Она регулирует ряд важных процессов: термогенез, защитные ответы на атаки патогенов, синтез этилена и созревание плодов. Также существуют данные, что SA участвует в регулировании ответов растений на абиотические стрессы, в частности УФ излучение и озон [15].

SA – системный сигнал для SAR. Исследования показали, что большинство накапливающейся SA (69%) было синтезировано и экспортировано из инокулированных листьев. В других исследованиях было показано, что SA была найдена и в инфицированных листьях и синтезирована de novo [6].

Последние данные подтверждают, что сигнализирование может происходить и за счет преобразования SA в летучее соединение метиловый салицилат, который может вызвать устойчивость не только в незараженных частях этого самого растения, но также и у соседних растений [6].

Синтез SA

SA может быть синтезирована в растениях путем превращения фенилаланина в транс-коричную кислоту, которая синтезирована ферментом фенилаланин аммиак-лиазой (phenylalanine ammonia-lyase или PAL). Фермент PAL является светоиндуцируемым. Поэтому в темноте накопление SA происходит медленно, а защитные реакции протекают с низкой интенсивностью. Недавно было показано, что SA может также синтезироваться из бензойной кислоты (ВА), которая может быть гидраксилированна в SA [1].

Также было показано, что как и у бактерий SA может синтезироваться из хоризмата через изохоризмат. Экспрессия бактериальных ферментов, катализирующих эти реакции изохоризмат синтаза 1 (ICS1) и изохоризмат пируват лиаза 1 (IPL1), в табаке и Arabidopsis привело к повышенному накоплению SA и устойчивости к патогену. Изохоризматный путь синтеза в растениях – главный источник синтеза SA.

SA можно обнаружить в двух формах в растении: (i) свободная SA, которая возможно имеет сигнальную функцию и (ii) главная запасающаяся форма Я-O-D-глюкосалициловая кислота (SAG) [5]. Этот гликозид ассоциирован с клеточной стенкой и расщепляется специфической в-гликозидазой. При действии стрессов нетравматического типа происходит высвобождение в-гликозидаз клеточной стенки. Затем происходит расщепление гликозида и высвобождению свободной SA. Таким образом, превращение SAG в свободную и активную SA может значительно повлиять на сигнальную передачу SA [1].

Транспорт системного сигнала

SA была обнаружена во флоэме нескольких видов растений, это позволило предположить, что именно это вещество является флоэмно-транслоцируемым сигналом. Эксперименты подтвердили, что сигнал SAR инициируется в инокулированных листьях, и транспортируется по проводящей системе (флоэма) к верхним листьям [1, 6].

Активные формы кислорода (ROS)

Существует несколько салицилат-связывающих белков. Главными мишенями для внеклеточной SA являются внеклеточные каталазы и пероксидазы. Присоединяясь к молекулам этих ферментов, SA изменяет их каталитическую активность и запускает окислительную вспышку – резкое усиление синтеза активных форм кислорода. Салициловая кислота является ключевой молекулой, запускающей в растительном организме этот процесс [1].

Во внеклеточном пространстве накапливается перекись водорода: HO2∙ + O2∙ ─ + Н+ ↔ Н2О2 + О2 либо 2O2∙ ─ + 2Н+ ↔ Н2О2 + О2, это приводит к накоплению других активных форм кислорода – супероксидного аниона (O2∙ ─), гидроксильного радикала, синглетного кислорода и др. Во внеклеточном пространстве растения происходит окислительная вспышка, она разрушительно воздействует на патогенные микроорганизмы.

Поскольку H2О2 не имеет неспаренного электрона, она может пересекать биологические мембраны. Протонирование O2∙ ─, которое происходит более легко при низком рН, дает гидропероксильный радикал HO2, он может пересекать биологические мембраны примерно так же эффективно, как и H2О2. HO2∙ может непосредственно атаковать жирные кислоты, и, как показано, превращает линоленовую, линолевую и арахидоновую кислоты в перекиси липидов.

Также перекись водорода является главным вторичным мессенжером сигнала индуцирования устойчивости. SA запускает экспрессию PR-генов благодаря ей. Перекись водорода способна индуцировать активность ряда важных ферментов, таких как NADH-дегидрогеназ (NADH-DH) хлоропластов, что также играет определенную роль в генерировании SAR.

Второй группой салицилат-связывающих белков являются пероксидазы - регуляторные ферменты. Кислые пероксидазы клеточных стенок способны связывать SA, фермент начинает генерировать перекись водорода с использованием NADPH.

Лигниназы сохраняют свою пероксидазную активность на прежнем уровне или даже повышают ее.

Активные формы кислорода крайне опасны для самого растительного организма, поэтому в растении существуют надёжные механизмы регуляции окислительной вспышки. Протекание окислительной вспышки допускается только во внеклеточном пространстве, а внутри клеток этот процесс подавляется компонентами антиоксидантной системы [1].

Альвазер и другие обнаружил, что H2O2 накапливается в маленьких группах клеток в неинокулированных листьях Arabidopsis после инфицирования его авирулентным штаммом P. syringae. Эти микровспышки наблюдаются на протяжении двух часов после начальной окислительной вспышки в инокулированных тканях, затем наблюдается формирование микроскопических HR повреждений. Используя каталазу чтобы удалить H2O2 или DPI чтобы ингибировать NADPH оксидазу, было показано, что обе окислительные вспышки необходимы для индуцирования SAR. Авторы предполагают, что микровспышки ROS могут акивировать защингые реакции на низком уровне во всем растении [6].

Липидные сигнальные молекулы

Новые работы подтверждают, что липидные молекулы могут быть мобильными сигналами для SAR. Мальдонадо показал, что мутанты dir1 (defective in induced resistance 1) развивают нормальную местную устойчивость к патогену, но не способны развивать SAR или экспрессировать PR белки в системных листьях. Таким образом, дикий тип dir1, который имеет сходство с липидным транспортом белков (LTPs), может участвовать в генерации или передаче мобильного сигнала.

Внеклеточное расположение LTPs подразумевает наличие мембранных рецепторов (PM), участвующих в передаче сигнала [6].

Регуляторный белок NPR1

Ключевой регулятор в развитии SAR является NPR1-белок. В норме NPR1 экспрессируеся в растении в малом количестве, но после проникновения патогена и обработки SA его уровень повышаетя в два – три раза. Он имеет две белок-белковые зоны взаимодействия, анкириновые повторности и BTB/POZ (Broad-Complex, Tramtrack, Bric-a-brac/Poxvirus, Zinc finger), а также предполагаемый сигнал ядерной локализации и области фосфорилирования [6].

Когда уровни SA низкие, NPR1 находится в своей олигомерной форме в цитоплазме, а в ответ на действие SA, регуляторный белок диссоциирует на мономеры, перемещается в ядро, и взаимодействует с факторами транскрипции TGA, тем самым, индуцируя экспрессию PR генов [6].

Для активации экспрессии гена PR-1 необходимы факторы TGA 2, 5 и 6. Для полной экспрессии данного гена необходим также фактор транскрипции WRKY70 [5].

Ядерная локализация NPR1 и активация TGA факторов возможно регулируются изменением окислительно-восстановительного потенциала клетки после обработки SA.

Когда белки были исследованы без восстановителя DTT, NPR1 обнаруживался только в обработанных SA образцах, тогда как при наличии DTT мономеры NPR1 были обнаружены в равных количествах с и без обработки SA [6].

Было установлено, что роль NPR1 в растениях не ограничивается SAR. NPR1 играет важную роль при ограничении роста патогенов. NPR1 также требуется для индуцирования другой защитной устойчивости (ISR), которая вызывается непатогенными, колонизирующими корни бактериями. NPR1 выступает посредником между пересекающимися сигнальными путями салициловой кислоты (SA), жасмоновой кислоты JA и этилена (C2H4), которые вызывают устойчивость к насекомым и некоторым некротрофным патогенам. NPR1 участвует в детоксикации SA и обратной регуляции ее биосинтеза. Кроме того NPR1 участвует в процессах, которые непосредственно не связаны с устойчивостью, например регуляция клеточного деления [6].

2. Объекты и методы исследования

Работа выполнялась на базе кафедры микологии и фитоиммунологии ХНУ им. В. Н. Каразина с 2008 по 2010 годы. Сбор материала проводился на территории Харьковской области в период с 2008 по 2009 годы.

Объектами исследования были изоляты гриба A. alternata f. sp. lycopersici, выделенные из пораженных плодов и листьев томатов. Также объектами исследования были проростки растений томатов.

2.1 Выделение гриба в чистую культуру и подготовка растений к инокуляции

Из пораженных образцов томатов были выделены чистые культуры гриба. Выделение чистой культуры проводилось с использованием стандартных микробиологических методов. Посев осуществлялся в чашках Петри на агаризованную питательную среду – картофельно-глюкозный агар. Также в колбы по 100 мл на жидкую питательную среду Чапека. Семена растений томатов Лагідний и КВС, помещали в стаканчики с универсальной почвой. Дальнейшее исследования проводились с 50 дневными растениями. Опыт осуществлялся в 3-х повторностях.

2.2 Инокуляция растений

А) Инокуляция стеблей

Растения инокулировали в возрасте 8 недель. Для инокуляции растений основной стебель горизонтально срезали стерильным лезвием. Одну высечку мицелия, диаметром 5 мм, аккуратно помещали мицелием вниз на срезанный стебель. Инокулированные растения инкубировали во влажной камере в течение 48 часов. Через два дня зараженные растения помещались в комнату с меньшей влажностью. Длину поражений (в мм) на каждом растении измеряли на 4 и 7 сутки после инокуляции.

Б) Инокуляция листьев

Листья 60 дневных растений томатов, помещались на фильтровальную бумагу в чашки Петри, предварительно смоченную дистиллированной водой, для достижения необходимой влажности. На листья аккуратно помещали капли с суспензией спор (концентрация ……). Инокулированные листья оставляли в чашках Петри на протяжении 48 часов, после чего отмечали появление хлоротических пятен вокруг капель.

В) Оценка поражений на токсичность

Проводились срезы 8 недельных растений томатов под струей воды, затем эти срезы помещались в колбы на 100мл с культуральными фильтратами

A. alternata f. sp. lycopersicy. Растения оставляли в колбах на протяжении 24 часов. После чего наблюдали степень увядания растений томатов.

2.3 Статистическая обработка данных

Статистическая обработка данных проводилась с использованием дисперсионного анализа (р < 0,05). Вычисления проводились при помощи программы Statistica 6.0.

3. Результаты собственных исследований

В ходе проведения исследования нами было выделено в чистую культуру 3 изолята A. alternata f. sp. lycopersicy. Выделение изолятов проводилось из растений томатов.

3.1 Оценка устойчивости растений и вирулентности изолятов гриба при инокуляции листьев

В ходе наших исследований были испытаны различные методы заражения растений и проведена оценка их устойчивости к этому патогену.

При инокуляции стеблей томатов наблюдалось образование некротической зоны от светло-коричневого до черного цвета. (фото С1, С2, С3; КВС1, КВС2, КВС3)

По результатам дисперсионного анализа при инокуляции стеблей двух сортов томатов было установлено, что существует четкая разница между 3-мя изолятами гриба

A. alternata f. sp. lycopersici, между сортами, а также между сутками инокуляции (Табл. 1).

Изолят I более вирулентен, по отношению к изоляту II и III. При заражении стеблей томатов сорта КВС изолятом I некротическая зона на 4 сутки составила 5 мм, а на 7 сутки – 6,25 мм. При заражении сорта КВС изолятом II некротическая зона на 4 сутки составила – 3,5 мм, на 7 сутки – 5,25 мм. При заражении сорта КВС изолятом III некротическая зона на 4 сутки составила 3,5 мм, а на 7 сутки – 4 мм (Рис. 7.).

При заражении стеблей томатов сорта С изолятом I некротическая зона на 4 сутки составила – 5,75 мм, на 7 сутки – 6,5 мм. При заражении стеблей изолятом II, некротическая зона на 4 сутки составила – 5 мм, на 7 сутки – 6,25 мм. При заражении стеблей изолятом III, некротическая зона на 4 сутки составила – 4 мм, на 7 сутки – 5 мм (Рис. 8.).

Сорт С является более восприимчивым, по отношению к сорту КВС (Рис. 9.). Так, средний размер некроза при заражении 3-мя изолятами у сорта С на 4 сутки составил – 4,91 мм, а у сорта КВС – 4 мм. На 7 сутки средний размер некроза при заражении 3-мя изолятами у сорта С составил – 5,91 мм, у сорта КВС – 5,16 мм .

Таблица 1.

Результаты дисперсионного анализа при заражении стеблей томатов

3.2 Оценка устойчивости растений и вирулентности изолятов гриба при инокуляции листьев каплями с суспензией спор

При инокуляции листьев томата сортов КВС и С наблюдалось образование хлоротических пятен на месте нанесения капель. При визуальной оценке мы выявили, что хлороз практически не образовался на листьях сорта КВС, более хорошо выражен на листьях сорта С.

Наибольшая площадь хлротических пятен наблюдалась под действием изолята I (фото)

3.3 Оценка устойчивости растений и вирулентности изолятов гриба при оценке повреждений на токсичность

Таблица 2.

Степень увядания растений томатов сортов КВС и С

Выводы

1. При проведении исследований в чистую культуру были выделены три изолята гриба A. alternata f. sp. lycopersici из пораженных растений томатов.

2. В результате отработки методов заражения на стеблях томатов была установлена четкая разница между изолятами гриба а также сортами. Более вирулентным оказался изолят I, более восприимчивый сорт – С.

3. При инокулировании листьев томатов наблюдалось появление хлоротических пятен. Больше хлоротических областей было на сорте С. Более вирулентным является изолят I.

4. При проверке действия токсинов на растения томатов установлена четкая разница между сортами. Более восприимчив сорт С.

Список использованной литературы

1. Акулов А. Ю. Индуцированная неспецифическая устойчивость растений: история и современность / А. Акулов, Д. Леонтьев. – Х.: Харьковский Национальный университет им. В.Н.Каразина, - 37 с.

2. Демидов Е. С. Методы селекции томата на устойчивость к альтернариозу / Демидов Е. С., Садыкина Е. И., Сайчук А. И. – Приднестровский научно-исследовательский институт сельского хозяйства. – 2006 . – 100 с.

3. Chaerani R. Tomato early blight (Alternaria solani ): the pathogen, genetics, and breeding for resistance / Reni Chaerani, Roeland E. Voorrips // J Jen Plant Pathol. – 2006, 72:335–347

4. Clouse D. Interaction of the asc Locus in F8 Paired Lines of Tomato with A lternaria alternata f. sp. lycopersici and AAL-Toxin / D. Clouse, D.G. Gilchrist // Phytopathology. – 1987. – p. 80-82.

5. Custers J. H.H.V. Engineering disease resistance in plants: дис. Custers Jerфme H.H.V. – W., 2007. – 182 s.

6. Durrant W.E Systemic acquired resistance / W.E. Durrant, X. Dong // Phytopathology. – 2004. – N. 42. – p. 185 – 209.

7. Franklin L. Alternaria Deseases / Laemmlen Franklin // Agriculture and Natural Resources. – 2001.

8. Fritz M. Resistance induction in the pathosystem tomato – Alternaria solani: dissertation: 30.09.05 / Maendy Fritz. – G., 2005. – 124 s.

9. Fungal Databases Nomenclature and Species Banks [Electronic resource]

10. Magan N. Effect of Water Activity and Temperature on Mycotoxin Production by Alternaria alternata in Culture and on Wheat Grain / Naresh Magan, George R. Cayley, John Lacey // Applied and environmental microbiology. – 1984. - Vol. 47, No. 5. - p. 1113-1117.

11. Mesbah. L. A. Sensitivity among species of Solanaceae to AAL toxins produced by Alternaria alternata f.sp. lycopersici / L. A. Mesbah, G. M. van der Weerden, H. J. J. Nijkamp, J. Hille // Plant Pathology. – 2000. - Vol. 49. – p. 734-741.

12. Morisseau C. Multiple Epoxide Hydrolases in Alternaria alternata f. sp. Lycopersici and Their Relationship to Medium Composition andHost-Specific Toxin Production / Christophe Morisseau, Barney L. Ward, David G. Gilchrist, Bruce D. Hammock // Applied and environmental microbiology. – 1999. - Vol. 65, No. 6. - p. 2388–2395.

13. Motta S. A method for the determination of two alternaria toxins, alternariol and alternariol monomethyl ether, in tomato products / Silvana da Motta, Lucia M. Valente Soares // Brazilian Journal of Microbiology. – 2000. – Vol. 31. – p. 315-320.

14. Nishimura S. Host-specific toxins and chemical structures from Alternaria species / Syoyo Nishimura, Keisuke Kohmoto // Ann. Rev. Phytopal. – 1983. – p.87-116

15. Norman C., Howell K. A. et al. Salicylic Acid Is an Uncoupler and Inhibitor of Mitochondrial Electron Transport // Plant Physiol. Australia, 2004, Vol. 134, pp. 492–501.

16. Pound G. S. The production of toxic material by alternaria solani and its relation to the early blight disease of tomato / Glenn S. Pound, Mark A. Stahmann // Phytopathology. – 1951. – Vol.41. – p. 1104-1114.

17. Seo H.S., Song J.T. et al. Jasmonic acid carboxyl metiltransferase: A key enzyme for jasmonate-regulated plant responses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2001, Vol. 98. No 8. – p. 4788-4793.

18. Thoma B. P. H. J. Alternaria spp.: from general saprophyte to specific parasite // Bart P. H. J. Thoma // Molecular Plant Pathology. – 2003. – Vol. 4. No. 4. – p. 225–236.

19. Vйlez H. Alternaria alternata mannitol metabolism in plant-pathogen interactions: dissertation / Heriberto Vйlez. – R., 2005. – 130 p.

20. Wang H. Apoptosis: A functional paradigm for programmed plant cell death induced by a host-selective phytotoxin and invoked during development / Hong Wang, Juan Li, Richard M. Bostock, David G. Gilchrist // The plant cell. – 1996. – Vol. 8. – p. 375-391.

21. Wang H. Fumonisins and Alternaria alternata lycopersici toxins: Sphinganine analog mycotoxins induce apoptosis in monkey kidney cells / Hong Wang, Clinton Jones, Janice Ciacci-Zanella, Todd Holt, David G. Gilchrist, Martin B. Dickman // Proc. Natl. Acad. Sci. – 1996. – Vol.93. No 8. – p. 3461-3465.

22. Witsenboer H. M.A. Effects of Alternaria Alternata f.sp. Lycopersici toxins at different levels of tomato plant cell development / Hanneke M.A. Witsenboer, Carla E. van Schaik, Raoul J. Bino, Huub J.M. Loffler, H. John J. Nijkamp, Jacques Hille // Plant Science. – 1988. – Vol. 56. – p. 253-260.

 /

Страницы: 1, 2