Метилотрофные бактерии - источники изотопно-меченных Н-2 и С-13 аминокислот 
Метилотрофные бактерии - источники изотопно-меченных Н-2 и С-13 аминокислот
БИОТЕХНОЛОГИЯ
МЕТИЛОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ - ИСТОЧНИКИ
ИЗОТОПНО - МЕЧЕННЫХ 2Н- и 13С- АМИНОКИСЛОТ.
@ О.В. МОСИН.
Московская государственная академия тонкой
химической технологии им. М.В. Ломоносова, 117571.
Изучена возможность использования различных штаммов
метилотрофных бактерий для получения аминокислот, меченных стабильными
изотопами 2Н и 13С, как секретируемыми в культуральную
жидкость в процессе ферментации штаммов-продуцентов, так и выделяемыми из гидролизатов
суммарного белка биомассы. Представлены данные по адаптации
L-фенилаланин-продуцирующего штамма факультативных метилотрофных бактерий
Brevibacterium methylicum к ростовым средам, содержащим 2 об.% С2Н3О2Н
и 98 об.% 2Н2О и биосинтезу L-фенилаланина. Для
L-лейцин-продуцирующего штамма облигатных метилотрофных бактерий
Methylobacillus flagellatum проведено культивирование на среде, содержащей 1
об.% 13СН3ОН и 99 об.% Н2О. Уровни изотопного
включения 2Н- и 13С в аминокислоты были изучены методом
масс-спектрометрии электронного удара в виде метиловых эфиров
N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных (дансильных) производных аминокислот и
бензилоксикарбонильных производных (Z-производных) аминокислот. Максимальные
уровни включения стабильных изотопов 2Н-и 13С в
аминокислоты при росте метилотрофных бактерий на средах, содержащих 2 об. % СН3ОН
и 98 об.% 2Н2O, и 1 об.% 13CH3OH и
99 об.% Н2О составляют 97,5% и 95% соответственно.
Ключевые слова: Стабильные изотопы. - Brevibacterium
methylicum. - Methylobacillus flagellatum. - Культивирование на 2Н2О.
- Изотопно-меченные аминокислоты.
ВВЕДЕНИЕ
Разработка путей биосинтетического
получения аминокислот, меченных 2Н и 13С является
актуальной задачей для современной биотехнологии. Стоимость полученных таким
способом изотопно меченных соединений значительно ниже, чем химически
синтезированных, что представляет интерес для поиска новых штаммов -
продуцентов аминокислот, способных к росту и биосинтезу на изотопно-меченных
средах.
Удобными и дешёвыми источниками изотопно-меченных аминокислот
могут быть метилотрофные бактерии, биотехнологический потенциал которых в
настоящее время общепризнан [1,2]. Субстратом для роста метилотрофов при
получении меченных аминокислот является метанол (или его меченные аналоги С2Н3О2Н/13СН3ОН),
и другие низкомолекулярные соединения, например, тяжёлая вода (2Н2О)
[3]. Однако, высокие концентрации 2Н2О в ростовой среде
могут вызвать ингибирование роста и развития метилотрофов [3]. Несмотря на
негативный биостатический эффект, оказываемый тяжёлой водой на клетки,
некоторые бактерии устойчивы к высоким концентрациям тяжёлой воды в среде [4],
в то время как растительные клетки могут нормально развиваются при
концентрациях не более 50-75 % 2Н2О, а клетки животных не
более 35 % 2Н2О [5]. В отличие от тяжёлой воды, при
использовании 13СН3ОН в качестве источника метки нет
необходимости проводить предварительную адаптацию культуры к изотопному
субстрату, так как показано, что изотопный эффект 13СН3ОН
незначителен [6]. Поэтому использование для получения 13С
-аминокислот облигатных метилотрофных бактерий, которые способны ассимилировать
только метанол в качестве единственного источника углерода и энергии является
очень перспективным.
В плане раннее начатых исследований с метилотрофами по получению
аминокислот, меченных стабильными изотопами, практический интерес представляет
использование метилотрофных бактерий, особенно продуцентов аминокислот для
получения целевых соединений за счет биоконверсии низкомолекулярных меченных
субстратов [7-10]. Традиционным подходом при получении аминокислот является
культивирование штаммов - продуцентов на средах, содержащих изотопно-меченные
субстраты и 2Н2О с последующим выделением меченных
аминокислот как из культуральной жидкости после ферментации штаммов-продуцентов,
так и из гидролизатов общего белка биомассы.
Целью данной работы было изучение принципиальной возможности
получения 2Н-и 13С-аминокислот за счёт использования
штаммов метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum и
Methylobacillus flagellatum .
УСЛОВИЯ
ЭКСПЕРИМЕНТА.
Бактериальные штаммы. Исследования проводили с
генетически маркированными штаммами метилотрофных бактерий, полученными из
коллекции культур Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ)
Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции
промышленных микроорганизмов:
1. - Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, лейцинзависимый штамм
факультативных метилотрофных бактерий, продуцент L-фенилаланина.
2. - Methylobacillus flagellatum KT, изолейцинзависимый штамм
облигатных метилотрофных бактерий, продуцент L-лейцина.
В работе использовали 2Н2O
(99,9% 2Н), С2Н3О2Н (97,5 % 2Н)
и 13СН3ОН (97,5 % 13С), полученные из
Российского научно-исследовательского центра “Изотоп” (Санкт-Петербург, РФ), а
также N-диметиламинонафталин-5-сульфохлорид (дансилхлорид) (Sigma, CША),
карбобензоксихлорид (Войковский химзавод, РФ).
Условия адаптации. Адаптацию штаммов к
дейтерию проводили на агаризованных средах (2 %-ный агар), содержащих тяжёлую
воду. При этом использовали рассев культур до отдельных колоний на средах,
содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды [9].
Культивирование бактерий проводили на минеральной среде М9
[11], как описано в работе [9].
Гидролиз белка проводили с использованием 6 н. 2 НСl
(в 2Н2О) и 4 н. Ва(ОН)2 (1100,
24 ч) [12].
Экстракцию липидов проводили смесью хлороформ-метанол (2:1)
по методу Блайя и Дайера [13].
Метиловые эфиры дансиламинокислот получали как описано в
работе [8].
Бензилоксикарбонильные производные аминокислот получали как
указано в работе [14].
Аналитическое и препаративное разделение
бензилоксикарбонильных производных аминокислот культуральной жидкости и
белковых гидролизатов проводили методом обращённо-фазовой высокоэффективной
жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) по раннее разработанной методике [15].
Разделение метиловых эфиров дансил-аминокислот проводили
методом обращённо-фазовой ВЭЖХ на жидкостном хроматографе “Knauer” (ФРГ),
снабженным насосом “Knauer”, УФ-детектором “2563” и интегратором “С-R
3A” (Shimadzy, Япония). Использовали неподвижную фазу: Separon SGX C 18, 7 мкм,
150 x 3,3 мм
(Kova, Чехословакия). Элюирование проводили в системе растворителей: (А) -
ацетонитрил-трифторуксусная кислота (20:80 об/об) и (В) - ацетонитрил. Использовали
градиентное элюирование: от 20% В до 100%В в течение 30 мин, при 100% В в
течение 5 мин, от 100% В до 20% В в течение 2 мин, при 20% В в течение 10 мин.
Ионнообменную хроматографию белковых гидролизатов проводили
на приборе “Biotronic LC 5001” (ФРГ), 230 x 3,2 мм, рабочее давление
50-60 атм, скорость подачи цитратного буфера 18,5 мл/ч, нингидрина 9,25 мл/ч,
детекция при 570 и 440 нм.
Количественное определение L-фенилаланина в культуральной
жидкости проводили на приборе “Beckman DU- 6” (США) при 540 нм, после обработки
препаратов культуральной жидкости нингидрином.
Масс-спектры электронного удара производных аминокислот
получены на приборе “MB-80A” (Hitachi, Япония) при энергии ионизирующих
электронов 70 эВ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Получение штаммов - продуцентов
аминокислот, адаптированных к максимальным концентрациям 2Н2О
в среде.
В рамках данной работы была
исследована возможность адаптации различных штаммов метилотрофных бактерий,
продуцентов аминокислот к росту на средах с максимальными концентрациями
тяжёлой воды. Для этого были проверены два из имеющихся в коллекции “ГосНИИ
Генетики” штаммов метилотрофных бактерий: штамм облигатных метилотрофных
бактерий M. flagellatum, продуцент L-лейцина и штамм факультативных
метилотрофных бактерий B. methylicum, продуцент L-фенилаланина.
Для проведения адаптации был выбран
ступенчатый режим увеличения концентрации 2Н2О в ростовых
средах, так как мы предположили, что постепенное привыкание организма к 2Н2О
будет оказывать благоприятный эффект на адаптацию. Этапы адаптации
метилотрофных бактерий к средам, содержащим максимальные концентрации 2Н2О
показаны на рис. 1 и схеме. Однако вопреки нашим ожиданиям, штамм облигатных
метилотрофных бактерий M. flagellatum обнаружил повышенную
чувствительность к тяжёлой воде (ингибирование роста бактерий наблюдалось при
концентрациях 2Н2О в среде 74,5 об.%) [3]. Дальнейшие
эксперименты по адаптации с данным штаммом метилотрофных бактерий не
проводились. В связи с этим в наших экспериментах по изучению уровней включения
дейтерия в аминокислоты использовались препараты культуральной жидкости и
биомасса M. flagellatum, полученная со среды, содержащей 74,5
об.% 2Н2О и 1 об.% С2Н3О2Н.
Раннее нами был описан метод
адаптации штамма факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum к
росту при сохранении способности к биосинтезу фенилаланина на максимально
дейтерированной среде [7]. В данной работе были исследованы образцы биомассы
штамма B. Methylicum (рис.1), полученные в ходе многоступенчатой
адаптации его к тяжёлой воде на средах с различным содержанием 2Н2О
(от 0; 24,5; 49,0; 74,5; об% до 98 об% 2Н2О). Поскольку
данный штамм метилотрофных бактерий удалось адаптировать к максимальным
концентрациям 2Н2О в ростовой среде, исследование уровней
включения дейтерия в аминокислоты суммарных белков биомассы представлялось
наиболее интересным.
Факультативные
метилотрофные
Облигатные метилотрофные
бактерии B. methylicum-источники
бактерии M. flagellatum,
2Н-аминокислот
источники 2Н-и 13С-
аминокислот
Многоступенчатая адаптация бактерий к
2Н2О
на средах, содержащих 0; 24,5; 49; 74,5; 98
об.% 2H2O
B. methylicum,
адаптированный M.
flagellatum,
к 98 об.% 2Н2О и 2 об.%
С2Н3О2Н
замедление роста
на
среде, содержащей 74,5 об.% 2Н2О
Культивирование на
средах,
Культивирование на среде,
содержащих различные
концентрации содержащей
обычную воду
2Н2О
и 1 об.% 13СН3ОН
Культуральная жидкость после
биомасса биомасса Культуральная жидкость
после отделения от
клеток
отделения от
клеток
2Н-секретируемые аминокислоты 13С-секретируемые
аминокислоты
Гидролиз суммарных белков в
4н. Ва(ОН)2 или 6 н. 2НСl ( в 2Н2О)
2Н-и 13С-аминокислоты
в
составе белковых гидролизатов
Обработка DnsCl и CH2N2
Обработка ZСl
Оценка уровней изотопного
Обращённо-фазовая Обращённо-фазовая ВЭЖХ
включения методом масс-
ВЭЖХ метиловых Z-производных аминокислот
спектрометрии метиловых эфиров
дансил- аминокислот
эфиров дансил-аминокислот
аминокислот
Оценка уровней изотопного
Схема
Адаптация
метилотрофных бактерий к средам, содержащим максимальные концентрации 2Н2О
и получения 2Н-и 13С-аминокислот.
Изучение ростовых характеристик M.
flagellatum на средах, содержащих СН3ОН/С2Н3О2Н/13СН3ОН
и 2Н2О.
Данные по росту штамма М.
flagellatum на минимальных средах, с 1 об.% СН3ОН (С2Н3О2Н/13СН3ОН)
и содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды приведены в
таблице 1. Как видно из таблицы 1, на средах, содержащих обычную воду и аналоги
метанола С2Н3О2Н и 13СН3ОН
выходы микробной биомассы составили 81% и 72% соответственно, а на средах с
74,5 об.% 2Н2О выход биомассы составил 29%, что в 3,4
раза ниже, чем в контрольных экспериментах, когда использовали простую воду и
метанол (табл. 1, опыты 1, 3, 8). Как видно из таблицы 1, устойчивый рост у M.
flagellatum сохранялся лишь в средах, содержащих меньше чем 74,5 об.% 2Н2О.
Выше этой концентрации наблюдалось ингибирование роста.
Таблица 1.
Влияние изотопного состава среды на рост штамма M.
flagellaum.
| 
