Использование метода люминесцентной микроскопии в исследовании микроводорослей

1) Яркое пурпурно-красное свечение характерно для хлорофиллсодержащих клеток наиболее высокой жизнеспособности – клетки находятся в активном состоянии, интенсивно делятся или готовятся к делению (логарифмическая фаза роста).

2) Красное свечение меньшей яркости (тускло-бордовое или розово-красное), присуще клеткам на стационарной фазе роста культуры водорослей.

3) Оранжево-красный оттенок свечения дают клетки, угнетённые под влиянием какого-либо фактора, а бледно-оранжевое свечение имеют клетки с очень низким уровнем жизненной активности, но ещё живые. 4) Тускло-красным светятся старые клетки с ослабленной жизненной активностью.

5) Голубовато-зелёное и оливково-зелёное свечение характерно для мёртвых клеток и детрита, а также нитчатых форм, когда остаются только контуры оболочек. Обычно этот тип свечения свойственен нитчатым формам, встречающимся в иловых отложениях. Синее свечение мёртвых клеток водорослей, остатков высшей водной растительности наблюдается в загрязнённых источниках.

Оттенки свечения при просмотре придонного и культурального материала ясно различимы и могут быть идентифицированы путём сравнения спектров. В стадии интенсивного роста клеток в культуре мёртвые клетки могут отсутствовать, что связано с их быстрым лизисом.

Путём подсчёта живых и мёртвых клеток водорослей в культурах и их автолизах с помощью люминесцентной микроскопии устанавливается специфичность процессов развития и распада различных видов водорослей. По степени быстроты развития и распада можно выделить следующие группы водорослей: 1) быстро растущие и быстро автолизирующиеся, 2) быстро растущие и медленно автолизирующиеся, 3) медленно растущие и быстро автолизирующиеся, 4) медленно растущие и медленно автолизирующиеся. Скорость роста и распада у отдельных видов водорослей при действии токсикантов может значительно варьировать. Так у диатомовых водорослей (без внесения токсикантов) при достижении наивысшей точки размножения клеток наступает быстрый их распад (2-3 дня) вплоть до растворения створок. Наибольшей продолжительностью жизни обладают клетки сине-зелёной водоросли Oscillatoria, нарастание и развитие которых происходит в лабораторных культурах в течение нескольких лет; длителен и процесс их распада. Наличие мощной слизистой оболочки, выполняющую защитную роль и состоящей из трудно гидролизуемых углеводов, по-видимому, обеспечивает надёжную защиту этих водорослей от неблагоприятных внешних воздействий. Поэтому и влияние токсиканта на клетку будет затруднено, свечение её из-за наличия толстой углеводной оболочки будет более бледным. [2]

Использование люминесцентных микроскопов даёт возможность проведения достаточно быстрой и точной оценки степени жизнеспособности клеток водорослей. Данный метод показывает глубокую поражаемость каждой отдельной клетки, даёт возможность оценить специфичность процессов развития и распада различных видов водорослей. Ранние изменения в пигментном аппарате можно установить, наблюдая за изменением флуоресценции хлорофилла или длительным послесвечением (замедленная флуоресценция). [4]

На основании этих знаний можно провести определение состояния клеток водорослей в иловых отложениях, почвенных образцах, песчаных отложениях и др.

Исследование проводится по следующей методике. Поверхностную часть донного образца из границы раздела ил/вода аккуратно наносят тонким слоем (до 0,5 мм) на предметное стекло. Иловым мазком покрывают примерно 2/3 поверхности стекла. При нанесении иловых отложений на стекло необходимо стремиться к максимальной выровненности поверхности. Стёкла с иловым мазком рассматривают в УФ-свете (освещение сверху через опак-иллюминатор). На тёмной поверхности мазка ярко флуоресцируют клетки водорослей, частицы детрита.

Возможны три варианта просмотра препарата на предметном стекле: 1) на предметное стекло наносится капля воды с водорослями, накрывается покровным стеклом и микроскопируется; 2) нанесённая капля просматривается с помощью водного иммерсионного объектива; 3) капля наносится на мембранный фильтр во избежание текучести препарата, накрывается покровным стеклом и просматривается под микроскопом. На покровное стекло наносят каплю анизола для более чёткой видимости объекта.

Подсчет клеток в отражённом свете с применением термопольного конденсатора проводят с учётом в последующем общей численности клеток, полученной при свете клеток в камере Горяева. В полевых условиях при просмотре природного фитопланктона подсчитывают клетки основных преобладающих групп водорослей: зелёных, сине-зелёных, диатомовых. При количественных подсчётах соотношения живых, мёртвых и отмирающих клеток и колоний водорослей готовят серию иловых мазков (4-10), в каждой из которых просчитывают 10 полей зрения по длине илового мазка (а для получения достоверных результатов число полей зрения следует увеличивать до 50-100). Соотношение клеток на разных физиологических этапах выражают в процентах от общей численности или в миллионах (тысячах) на 1мл (миллиардах на 1 литр). Полученные результаты представляют графически в виде таблицы при сравнении с таковыми в контроле.

При подсчёте учитывают три категории свечения: яркие пурпурно-красные клетки или колонии с высокой жизненной активностью; клетки с тускло-красным и оранжево-красным свечением - отмирающие, с низкой жизненной активностью; салатно-зелёные – мёртвые. На основании проведённого просчёта определяют процентное соотношение различных клеток (колоний) водорослей в зависимости от их физиологического состояния. [2]

3.2 Количественная регистрация интенсивности флуоресценции

По характеру нативного свечения в УФ-лучах можно с достаточной точностью диагностировать степень жизнеспособности клеток водорослей. Однако глазомерные оценки интенсивности свечения требуют выражения их в определённых и достаточно объективных количественных показателях. В связи с изменением спектра флуоресценции клеток водорослей при разных физиологических состояниях (см. выше) возникает необходимость разработки методов быстрой количественной регистрации интенсивности нативного свечения хлорофиллсодержащих клеток, как источника объективной информации о состоянии их жизненной активности.

Для количественного измерения интенсивности свечения может быть использована специальная установка, собранная из отдельных блоков - микроскопа МЛД-1, ФЭУ-22, источника питания Б5-24 (ВС-22), микрорентгенометра, автоматического потенциометра ЭПП-09.

Микроскопирование альгологических объектов проводится с помощью люминесцентного микроскопа МЛД-1, предназначенного для визуального наблюдения объектов в свете их люминесценции, возбуждаемой ультрафиолетовой областью спектра. Принцип работы прибора основан на использовании явления люминесценции объектов, возникающей под действием лучей определённого спектрального состава.

Объекты освещают сверху через опак-иллюминатор и объектив по методу светового поля. Возбуждение люминесценции через объектив, т.е. с той же стороны, что и её регистрация, позволяет в значительной мере уменьшить ошибки, связанные с реабсорбцией люминесценции.

Интенсивность свечения образцов регистрируется с помощью фотоэлектронного умножителя ФЭУ-22, присоединённого к микроскопу через имеющееся в верхней части головки отверстие для фотографирования. ФЭУ питается от стабилизированного источника питания. Регистрация сигналов с ФЭУ осуществляется усилителем постоянного тока с помощью микрорентгенометра и последующей фиксацией на ленте автоматического потенциометра ЭПП-09. Для интенсивности флуоресценции отражающее зеркало откидывают с помощью рукоятки. При этом направляют световой поток на ФЭУ, а величину фототока регистрируют микрорентгенометром.

Величину участка флуоресцирующего препарата регулируют с помощью диафрагм, имеющихся в оптической схеме микроскопа. Используя числовые показатели, можно снимать интенсивность флуоресценции строго с определённого по величине участка. Последний может быть представлен целым трихомом, колонией, пучком трихомов или единичной клеткой.

Особое значение имеет техника приготовления препарата. Для плотных суспензий водорослей с размерами клеток более 10 µ микроскопируют каплю исследуемого образца. Её наносят на предметное стекло, прикрывают покровным и микроскопируют. При исследовании неплотных суспензий с размерами клеток в пределах 4-7 µ отдельную клетку можно выделить только при использовании иммерсионной системы и объективов с увеличением 60-90 и более раз. Поэтому необходимо провести предварительное сгущение образца. Это делают либо путём центрифугирования – микроскопируют осадок, либо после фильтрования определённого объёма суспензии (1-10 мл) через мембранный фильтр. Настройку и чёткость видимости деталей препарата осуществляют с помощью макро- и микровинтов при отсутствии сигнала на ФЭУ. Величина фототока пропорциональна интенсивности свечения и с достаточной чувствительностью регистрируется микрорентгенометром.

Смонтированная по указанной блок-схеме установка даёт возможность не только измерять интенсивность участков препарата и получать количественные характеристики флуоресценции, отвечающие определённым жизненным состояниям клеток водорослей, но и снимать временную характеристику изменения интенсивности свечения, которая позволяет судить о состоянии хлорофилл-белково-липоидного комплекса. [13]

3.3 Оценка степени токсичности отдельных веществ для водорослей

Методы люминесцентного анализа и измерения флуоресценции хлорофилла были применены для оценки степени токсичности отдельных веществ для водорослей, макрофитов, фитообрастаний в лабораторных, полевых и экспедиционных условиях, на модельных экосистемах, а так же для оценки токсичности сточных вод и загрязнения природных водоёмов.

С помощью этого метода можно провести тестирование на культурах водорослей различных веществ: пропанида, смеси сатурна и пропанида, метафоса, смеси фенола и формальдегида. Измерение флуоресценции хлорофилла показывает быструю реакцию фотосинтетического аппарата клеток различных видов водорослей на внесение веществ (самыми токсичными являются пропанид, метафос, смесь пропанида и сатурна). Результаты люминесцентного микроскопирования показывают, что глубокого изменения в клетках водорослей Chlorella vulgaris и Scenedesmus quadricauda внесение токсикантов не вызывает. Более чувствительна к данным веществам морская жёлто-зелёная водоросль Phaeodactilum trucornutum наблюдается лизис мёртвых клеток в присутствии пропанида и значительное (в 7 раз) снижение численности клеток после внесения в культуру метафоса.

Эксперименты, проведённые в данном направлении, позволяют предположить, что если в водоёмы будут постоянно поступать загрязняющие вещества в невысоких концентрациях, то при благоприятных температурных условиях и достаточном количестве питательных веществ могут развиваться сине-зелёные водоросли, клетки которых имеют защитный слой слизи, через которую поступление токсического вещества затруднено, а продукция ценных в кормовом отношении водорослей будет подавлена. Такие изменения в дальнейшем могут привести к перестройке биоценоза: водоём из ценного рыбохозяйственного может превратиться в малоценный с измененным составом воды. [15]

3.4 Определение содержания витаминов в растительных клетках

С помощью флуоресцентной микроскопии возможно определение содержания витаминов в образцах, благодаря их собственной флуоресценции и с применением флуорохромов. Во многих случаях этот метод даёт лучшие результаты, чем самый тонкий химический анализ, не позволяющий, например, судить о распределении витаминов в органах и тканях. В связи с этим метод особенно широко применяется в медицине и физиологии животных.

Витамин А характеризуется светло-зелёной быстро затухающей флуоресценцией. Её можно наблюдать в свежем нефиксированном виде, но более плодотворным является метод окраски тканей с помощью флуорохромов. Флуоресцентное микроскопирование в данном случае может служить методом дифференциации витаминов А1 и А2: витамин А1 даёт характерную светло-зелёную флуоресценцию, а витамин А2 – красноватую. Различие в интенсивности флуоресценции с успехом используется для анализа смеси свободного витамина А и его эфиров.

Витамин В2 обладает собственной зелёной флуоресценцией (в некоторых животных клетках обнаружена так же жёлто-зелёная флуоресценция). Оптимум люминесценции данного вещества находится при рН от 3 до 9, что необходимо учитывать при проведении исследований. Типичная флуоресценция рибофлавина зависит от присутствия свободной 3-аминогруппы. Эта флуоресценция (максимум на 565 нм при рН 60) служит для количественного определения витамина В2. Интенсивность флуоресценции сравнивается с каким-либо стандартом (чаще всего чистый рибофлавин), она прямо пропорциональна содержанию витамина.

Витамин В1 не флуоресцирует ни в чистом виде, ни в водном растворе. Способность к сине-зелёной флуоресценции проявляет тиамин только в комплексе с носителем. При окислении витамин В1 превращается в тиохром – жёлтое вещество с интенсивно синей флуоресценцией. В щёлочном растворе тиохром очень чувствителен к свету и флуоресценция его исчезает необратимо. Свойством витамина В1 окисляться в тиохром пользуются в тесте на этот витамин: водный раствор тиамина окисляется посредством железосинеродистого калия в тиохром, флуоресценция которого определяется фотоэлектрически после экстракции тиохрома изобутиловым спиртом. Интенсивность флуоресценции зависит от щёлочности раствора и количества находящегося там тиохрома. Результаты, получаемые этим методом, находятся в полном соответствии с биологическими тестами.

Никотиновая кислота и её амид так же связаны с коллоидальным носителем. Амид никотиновой кислоты присутствует в двух коферментах: кодегидраза-1 и кодегидраза-2. Кодегидраза-2 встречается практически во всех живых клетках. Свойства его очень близки к свойствам кодегидразы-1: оба вещества бесцветны, растворимы в воде, нерастворимы в органических растворителях. Эти носители дают хорошую флуоресценцию при освещении в УФ-свете, что используется для их определения.

Витамин С в водном растворе не флуоресцирует. Только при большой концентрации аскорбиновой кислоты с коллоидным носителем появляются зелёные, довольно лабильные по отношению к ультрафиолетовым лучам капли.

Витамин К даёт типичную адсорбцию с максимумом при 234, 248, 261, 270 и 320 нм (в ультрафиолетовой области). Витамин К обладает белой флуоресценцией в свете аргоновой лампы. Н.А. Андреев и В.Н. Букин (1949) разработали количественный флуоресцентный метод определения фолиевой кислоты в клетках. Ими построена кривая распределения интенсивности в спектре флуоресценции кислоты, показано изменение интенсивности в спектре флуоресценции кислоты, показано изменение интенсивности свечения в зависимости от рН раствора. Описан метод экстрагирования кислоты, её адсорбции на активированном угле (обработанном анилином) с последующим элуированием спиртом: полученный раствор упаривают и окисляют перманганатом. Измерение интенсивности флуоресценции авторы проводят при рН 4,0-4,5, пользуясь светофильтром (470 нм), применяя в качестве стандарта раствор фолиевой кислоты концентрации 2 мл в 100 мл воды. Для полного извлечения фолиевой кислоты необходимо подвергать дополнительной ферментативной обработке продукты, которые содержат много белковых веществ. [1,3]

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Огромную роль в исследованиях физиологии растительных организмов на современном этапе играют флуоресцентные методы. Их неотъемлемой частью является люминесцентная микроскопия, получившая широкое применение в изучении различных параметров жизнедеятельности высших и низших растений. Этот метод обладает рядом преимуществ, заключающихся в быстроте, разносторонности и высокой точности исследований.

В частности, метод люминесцентной микроскопии позволяет быстрое выявление физиологического состояния клеток микроводорослей, что важно для изучения «цветения» водоёмов, определения качества водной среды.

Постоянно возрастающая антропогенная нагрузка на биоценозы требует быстрых и точных методик биотестирования вод. Для решения этой проблемы методом люминесцентной микроскопии проводится оценка степени токсичности отдельных веществ для водорослей.

Количественная регистрация интенсивности флуоресценции, которая может быть определена с помощью рассматриваемого метода исследования, является отправной точкой в изучении фотосинтетического аппарата микроводорослей, который, как известно, в первую очередь реагирует на малейшие изменения условий среды.

Особенностью люминесцентной микроскопии является возможность качественного и количественного определения нефлуоресцирующих веществ: витаминов, специфических белков, ферментов.

Люминесцентная микроскопия, в середине прошлого века нашедшая применение в изучении физиологии микроводорослей, занимает особое место в современной системе методов научного исследования. Благодаря развитию современной науки, открытию новых флуорохромов она приобретает всё большее значение для выявления физиологического состояния микроводорослей и определения качества водной среды.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бергольц, М.В. Люминесцентная микроскопия / В.М. Бергольц – М:Медгиз, 1953. – 312-314с.

2. Веселовский, В.А. Люминесценция растений / В.А. Веселовский, Т.В. Веселова. – М.: Наука, 1990.

3. Владимиров, Ю.А. Физико-химические основы фотобиологических процессов / Ю.А. Владимиров, А.Я. Потапенко. – М.: Высшая школа, 1989. – 30-35с.

4. Вопросы фотосинтеза / Под ред. М.М. Окунцова. – Томск: Издательство Томского университета, 1970. – 48-49с.

5. Изместьева, Л.Р Методы исследования фитопланктона / Л.Р. Изместьева, Н.Б. Усенко, О.М. Кожова // Сб. Мониторинг фитопланктона. – Новосибирск: Наука, 1992. – 26-30с.

6. Инге-Вечтомова, Н.И. Спектрофлуорометрические методы исследования биологических объектов / Н.И. Инге-Вечтомова, А.Ю. Батов; Под ред. В.В. Полевого, Г.Б. Максимова – Л.: Изд-во ЛГУ, 1986. – 102-118с.

7. Люминесцентные методы определения микроколичества элементов / Отв. ред. М.А. Остапенко. – М.: Всесоюзный научно-исследовательский ин-т хим. Реактивов, 1962. – 25-34с.

8. Маторин, Д.Н. Люминесценция хлорофилла в культурах микроводорослей в природных популяциях фитопланктона / Д.Н. Маторин, П.С. Венедиктов // Итоги науки и техники ВИНИТИ, серия Биофизика - т.40. – 1900. – 50-62с.

9. Методические вопросы изучения первичной продукции планктона внутренних водоёмов / Отв. ред. И.Л. Пырина. – С-Пб.: Гидрометиздат, 1993. – 120-132с.

10. Методы биотестирования вод [сборник статей] / Под ред. А.Н. Крайнюкова. – Новосибирск: Наука, 1988. – 41-49с.

11. Методы биотестирования качества водной среды / Под ред. О.Ф. Филенко. – М.: Изд-во МГУ, 1989. – 23-25с.

12. Опритов, В.А. Теоретические основы и методы изучения биофизических процессов у растений / В.А. Опритов, В.А Калинин, В.Г. Ретивин. – Горький: Изд-во ГГУ, 1979. – 36-40с.

13. Сиренко, Л. А. Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике / Л. А. Сиренко, А. И. Сакевич, Л.Ф. Осипов и др. – Киев: Наукова думка, 1975. - 57-63с.

14. Фёдоров, В.Д. О методах изучения фитопланктона и его активности / В.Д. Фёдоров. – Новосибирск: Наука, 1979. – 115-130с.

15. Франк, А.Н. Изучение распределения фитопланктона оптическими методами / Н.А. Франк. – Новосибирск: Наука, 1988. – 96с.

16. Эколого-физиологические исследования фотосинтеза и водного режима растений в полевых условиях. Труды всесоюзного совещания / Отв. ред. Р.К. Силяев. – Иркутск: Иркутская областная типография №1, 1983. – 27-32с.

SUMMARY

In the given work the scope of a method of luminescent microscopy is investigated. By means of this method it is possible to carry out various researches of microseaweed: revealing of a physiological condition of separate cells, an estimation of degree of toxicity of separate substances for seaweed, definition of the maintenance of vitamins in vegetable cells, quantative registration of intensity of fluorescence. This method is successfully applied in biotesting of quality of the water environment. Luminescent microscopy - a perspective direction in modern physiology of plants.

Страницы: 1, 2