Іонні механізми потенціалу дії. Методи фіксації

Первісний короткочасний викид струму являє собою ємнісний струм, обумовлений зміною заряду на мембрані в результаті зміни мембранного потенціалу. Якщо підсилювач зворотного зв'язку здатний проводити більші струми, то ємнісний струм триває дуже недовго. На практиці викид ємнісного струму триває близько 20 мс, і за ним треба невеликий, але стійкий вихідний струм.

Цей вихідний струм, що протікає через провідності, активні при потенціалі спокою, називається струмом витоку. Здебільшого це струм іонів калію й натрію, що має лінійну залежність від величини зсуву потенціалу фіксації від потенціалу спокою й з на всьому протязі стрибка потенціалу. Більшу частину часу, однак, цей струм замаскований іншими, набагато більшими по величині іонними струмами.

Ходжкін і Хакслі показали, що друга й третя стадії струму обумовлені спочатку входом іонів натрію, а потім виходом іонів із клітини. Їм також удалося виділити індивідуальні компоненти струму й розрахувати їхню величину й часовий хід. Одним із зручних способів домогтися цього послужило видалення з розчину більшої частини іонів натрію й заміна їх на іони холіну (які не проходять через мембрану). Знизивши зміст позаклітинного натрію, удалося домогтися того, що натрієвий рівноважний потенціал зрівнявся з деполяризованим мембранним потенціалом. Таким чином, сумарний струм зрівнявся нулю.

Метод петч-кламп (patch - clamp)

Наприкінці сімдесятих років XX в. Эрвін Неєр (E.Neher) і Берт Сакман (B.Sakmann) виявили, що конусоподібні скляні піпетки з діаметром кінчика 1-2 мікрона можуть утворювати контакти із клітинною мембраною (границі "мембрана - скло") з опором у декілька гігаом - це так званий гігаомний контакт. Він дозволяє ізолювати від зовнішнього середовища й від іншої частини мембрани той її фрагмент, що перебуває усередині піпетки. Відмежований піпеткою фрагмент мембрани й називається patch - "фрагмент", слово clamp (фіксація) у назві методу можна інтерпретувати і як захоплення й ізоляцію цього фрагмента, так й як фіксацію трансмембранного потенціалу в ізольованому фрагменті, або, як буде описано пізніше, потенціалу або струму на цілій клітині. У піпетку, заповнену розчином електроліту, міститься хлор-срібний електрод, другий електрод розміщується позаклітинно, в оточуючій рідини. Відмінність електричної схеми від раніше описаної для двохелектродної фіксації полягає в тім що той самий електрод використовується як для виміру різниці потенціалів, так і для подачі струму.

Величезна сфера, частина якої видна на моніторі в центрі фотографії - це клітина (овцит жаби Xenopus laevіs), що перебуває в цей момент на предметному столику мікроскопа, до нього підведена patch-піпетка, її діаметр у носика - близько 3 мікронів. Після встановлення гігаомного контакту вона ізолює фрагмент мембрани площею приблизно 7 мкм2, струм від іонних каналів у цьому фрагменті можна буде записувати.

Конфігурація "Cell-attached"

Тільки що описана конфігурація називається cell-attached patch-clamp (patch-clamp "із прикріпленою кліткою"). Вона ілюструється схемою 1.

Схема 1. Принципова схема patch-clamp у конфігурації Cell-attached.

Ця конфігурація, однак, має дві незручності. По-перше, вона не дозволяє з достатньою надійністю вимірювати, а, отже, і задавати трансмембранну різницю потенціалів - оскільки обидва електроди - як піпетковий, так і зовнішній, перебувають по одну сторону мембрани. Загалом кажучи, можна, використовуючи оточуючий розчин з іонною композицією, що повторює склад цитоплазми, деполяризувати мембрану поза піпеткою, так що різниця потенціалів між зовнішнім електродом і цитоплазмою зникне, а тоді різниця потенціалів між електродами буде дорівнювати трансмембранному потенціалу - але все це досить приблизно, тому що точний склад цитоплазми нам невідомий.

По-друге, ця конфігурація не дозволяє контролювати склад середовища поза піпеткою - там залишається цитоплазма, склад якої не цілком визначений. У силу цих причин cell-attached mode застосовується досить обмежено.

Конфігурація Іnsіde-out

Однак, якщо піпетку швидким рухом відвести від клітини, то "внутрішній" шматочок мембрани відірветься від клітини й вийде конфігурація іnsіde-out (зовнішня сторона усередині), названа так тому, що внутрішня, звичайно звернена до цитоплазми, сторона мембрани виявиться зовні - в оточуючому розчині, а зовнішня - усередині піпетки. (Схема 2) Альтернативний метод переходу в конфігурацію іnsіde-out полягає в наступному: з конфігурації cell-attached піпетку відводять плавно, формуючи із двох сторін закриту везикулу; потім піднімають піпетку в повітря й опускають у другу ванночку, із внутрішньоклітинним розчином. При переносі зовнішня мембрана везикули руйнується, у результаті формується конфігурація іnsіde-out.

Схема 2. Принципова схема patch-clamp у конфігурації іnsіde-out.

Тепер різниця потенціалів на фрагменті мембрани строго дорівнює різниці потенціалів між електродами. Очевидно, що при використанні такої модифікації піпетку заповнюють розчином, що імітує позаклітинне середовище, тоді як оточуючий розчин роблять близьким по складу до цитоплазми. При цьому, міняючи склад оточуючого розчину, можна вивчати, як такі зміни в цитоплазмі впливають на струм каналів, що цікавлять нас, - адже оточуючий розчин контактує із цитоплазматичною стороною мембрани.

Конфігурація Whole-cell

Якщо за умовами експерименту необхідно міняти склад позаклітинного середовища, можна використати конфігурацію whole cell ("англ. ціла клітина"). У цьому випадку піпетку не відводять від клітини, а подають у неї негативний тиск й у такий спосіб руйнують ізольований фрагмент мембрани.

Схема 3. Принципова схема patch-clamp у конфігурації whole-cell.

Після цього піпетка з'єднана із внутрішньоклітинним середовищем; оскільки клітина звичайно маленька, то, завдяки дифузії, склад цитоплазми незабаром виявляється ідентичним складу піпеткового розчину, тому ми, як й у попередньому випадку, знаємо як склад рідин, так і різницю потенціалів. Відзначимо, що якщо в конфігурації іnsіde-out піпетковий електрод був "позаклітинним", а внутрішній - "внутрішньоклітинним", те тепер вони помінялися ролями. З погляду вивчення струму через канали, перевага цього методу полягає в тому, що тут залишаються цілими клітинні структури й регуляторні механізми. Але є й недолік - ми вимірюємо сумарний струм всіх каналів у клітині, а не струми через одиночні канали.

Конфігурація Outsіde-out

Вирішити цю проблему дозволяє конфігурація outsіde-out (зовнішня сторона зовні). Якщо після переходу в whole-cell mode повільно відводити піпетку від клітини, мембрана не відривається відразу, а починає витягуватися в трубку (це видно на фото).

Початкова фаза переходу з Whole-cell в Outsіde-out. Перехід в outsіde-out. Заключна фаза.

Мембранна трубка стала зовсім тонкою й майже невидимою ("протуберанець" у поверхні клітини - це невелика частина цитоплазми, що залишилася в мембранній трубці). У наступну мить трубка порветься, а мембрана зімкнеться на піпетці в "вивернутому" виді - ми опинемось в конфігурації "outsіde-out"

Perforated patch

Perforated patch ("перфорований patch") - це специфічний варіант patch-clamp в whole-cell mode. У цьому випадку, у піпетковому розчині утримується невелика кількість спеціального антибіотика. наприклад, граміцидина. Антибіотики цього класу формують іонні канали в клітинній мембрані на ділянці, приєднаній до мікропіпетки.

Такий підхід дозволяє уникнути заміщення внутрішнього середовища клітини розчином з піпетки-електрода, тобто клітина залишається живою з мінімальними, наскільки це можливо, ушкодженнями. Таким чином, відповіді клітки на подразники є максимально наближеними до природного. У той же час, даному методу властиве ряд недоліків. По-перше, у порівнянні із класичним whole-cell mode, електричний опір доступу (яке складається з опору піпетки й опору в місці з'єднання піпетки з мембраною) є значно більш високим. Це знижує якість фіксації потенціалу, підвищує рівень шуму при записі, і збільшує значення всіх помилок, пов'язаних зі змінами опору повного ланцюга (від електрода в зовнішньому розчині до електрода в піпетці). По-друге, для того, щоб антибіотик подіяв, потрібно досить багато часу (до 30 хвилин), що істотно зменшує корисний період експерименту. І, по-третє, антибіотик ушкоджує мембрану також й у місці з'єднання з кінчиком піпетки, що приводить до прискореного руйнування гігаомного контакту й додатково зменшує ефективний експериментальний час. Таким чином, даний варіант методу може бути з успіхом використаний тільки в експериментах, які не вимагають тривалого часу для виявлення досліджуваних явищ.

Nucleated patch

Цікавий різновид patch-clamp - nucleated patch. (Фіксація потенціалу із клітинним ядром).

Метод полягає в наступному. Піпетка підводить до клітини, а потім ривком пробиває мембрану. Після цього кінчик піпетки підводить до клітинного ядра, на піпетку подається невеликий негативний тиск. У результаті піпетка присмоктує до ядра. Потім піпетка з ядром на кінці плавно приділяється назад і виймається із клітини. Піпетку необхідно вивести із клітини таким чином, щоб ділянка мембрани в місці виходу "наділася" на ядро, що присмокталося, і відірвалася, обернувшись довкола нього. У результаті виходить специфічний варіант outsіde-out patch, при якому набагато більший, ніж у звичайному варіанті методу, ділянка мембрани приєднана до кінця піпетки, будучи обгорнутою навколо клітинного ядра.

Фіксація потенціалу й фіксація струму

Коли вивчаються зміни провідності однотипних каналів у відповідь на якісь хімічні впливи або залежність їхньої провідності від різниці потенціалів на мембрані, зручно фіксувати потенціал і вимірювати струм каналу - як ми дотепер й описували. Цей, найчастіший варіант patch-clamp, називається voltage clamp (фіксація потенціалу). Однак, іноді дослідника цікавлять процеси трансмембранного переносу іонів, пов'язані зі зміною мембранного потенціалу - наприклад, проведення нервового імпульсу. У таких випадках можна надійти протилежним образом: зафіксувати на постійному рівні струм, і вивчати зміни різниці потенціалів при цьому. Такий варіант називається current clamp (фіксація струму).

Приклади записів, одержуваних методом patch-clamp

Запис струму одиночного каналу (гліцинового рецептора)

Запис одиночного каналу рецептора гліцину. Чітко видно два стани: закрите (йому відповідає нульовий струм) і відкрите (йому відповідає струм приблизно в 7 пикоампер). Канал час від часу спонтанно переходить із одного стану в інше, проміжних станів немає. Запис дозволяє одержати дві найважливіші характеристики каналу: провідність (виходячи з величин трансмембранного потенціалу й струму) і ймовірність знаходження у відкритому стані (обумовлене як відношення часу, коли канал відкритий до часу, коли він закритий). До слова, найчастіше активність каналу фізіологічно регулюється шляхом зміни цієї ймовірності.

Запис амилорид-чуттєвого струму в головній клітині збірної трубки бруньки в конфігурації whole-cell.

Запис у конфігурації whole-cell. Клітина епітелію збірної трубки. Трансмембранний потенціал -60 мВ. З інтервалами в 1 хвилину на 30 секунд в оточуючий розчин уводиться амилорид - інгібітор епітеліального натрієвого каналу (час введення показаний темними прямокутниками). До речі, чутливість до інгібіторів - це ще одна з найважливіших характеристик каналу. Введення амилорида щораз призводить до падіння струму до нуля, із чого видно, що практично вся провідність при -60 мВ у даній клітині - це провідність епітеліального натрієвого каналу. На противагу попереднього запису, зміни струму виглядають безперервними - це пов'язане з тим, що одночасно записується багато каналів (близько 2000), відповідно, є приблизно 2000 рівнів струму - від "усі відкриті" до "усі закриті".

Висновки

·                   Потенціал дії в більшості клітин виникає за рахунок короткочасного зростання натрієвої провідності, що прагне привести мембранний потенціал до рівня натрієвого рівноважного потенціалу й за яким треба збільшення калієвої провідності, що повертає мембрану в стан спокою.

·                   Зростання провідностей виникає завдяки потенціалзалежності натрієвих і калієвих каналів: імовірність їхнього відкриття зростає при деполяризації.

·                   Експерименти на аксоні кальмара з фіксацією потенціалу надали детальну інформацію про потенціалзалежності й тимчасовий хід змін провідностей. При деполяризації мембрани натрієва провідність спочатку швидко активується, а потім інактивується. Калієва провідність активується із затримкою й залишається на високому рівні доти, поки не скінчиться деполяризація.

·                   Часовий хід і потенціалзалежність змін натрієвих і калієвих провідностей у точності визначають амплітуду й часовий хід потенціалу дії, а також такі характеристики мембрани, як поріг активації й рефрактерний період.

·                   Теоретично активація натрієвої й калієвої провідностей при деполяризації повинна бути зв'язана зі зсувом заряду усередині клітини. Ці зсуви, названі воротними струмами, удалося виміряти експериментально.

·                   Експерименти з використанням методу пэтч-кламп доповнили відомості, отримані в більше ранніх досвідах з фіксацією потенціалу, новими деталями про процес збудження. Так, наприклад, натрієві канали відкриваються на досить короткий час, і ймовірність їхнього відкриття в ході деполяризації спочатку зростає, а потім знижується, відповідно до активації й інактивацією натрієвої провідності в цілій клітині. Різні кінетичні моделі були запропоновані з метою опису процесів активації й інактивації каналів.

·                   Кальцій відіграє важливу роль у збудженні. У деяких клітинах саме вхід кальцію, а не натрію, відповідає за фазу росту потенціалу дії. Крім того, позаклітинний рівень кальцію визначає збудливість мембрани. Зниження позаклітинної концентрації кальцію призводить до збільшення збудливості.

Література

1.                 Биофизика: Учеб. для биол. спец. унив. Под ред. Б.Н. Торусова и О.Р. Кольс. — М.:Высш.шк., 1968. — 467 стр.

2.                 Валькенштейн М.В. Биофизика: Учеб. пособие для биолог. и физиол. факультетов университетов. — М.: Наука, 1981. — 575 стр.

3.                 П.Г. Костюк, В.Л. Зима, І.С. Магура, М.С. Мірошниченко, М.Ф. Шуба Біофізика / За редакцією П.Г. Костюка. — Київ: «Обереги», 2001. — 544 стр.

4.                 П.Г. Костюк. Микроэлектродная техника. — К.: Изд-во АН УССР, 1960. — 244 стр.

5.                 Регистрация одиночных каналов / Под ред. Б.Сакмана, Э.Неера. — М.: «Мир», 1987. — 275 стр.

6.                 Рубин А.Б. Биофизика: Учеб. пособие для биолог. и физиол. факультетов университетов: В 2-х книгах. Кн.1. Теоретическая биофизика. — М.: Высшая школа, 1987. — 319 стр.

7.                 Рубин А.Б. Биофизика: Учеб. пособие для биолог. и физиол. факультетов университетов: В 2-х книгах. Кн.2. Биофизика клеточных процессов. — М.: Высшая школа, 1987. — 303 стр.

8.                 B. Sakmann, E. Neher Single-channel recording. — 1995.

9.                 Numberger M., Draguhn A. Patch-Clamp Technik. — 1996.

10.            Jan C. Behrends & Niels Fertig: Planar Patch Clamping. In: Neuromethods. Bd. 38, S. 411—433.

Страницы: 1, 2