Биологическое окисление
p> Энергия, высвобождаемая в процессе переноса электронов по дыхательной
цепи, запасается в форме электрохимического протонного градиента на
внутренней мембране митохондрий. Окислительное фосфорилирование возможно благодаря тесной ассоциации
переносчиков электронов с белковыми молекулами. Белки направляют электроны
по дыхательной цепи так, что они последовательно переходят от одного
ферментного комплекса к другому, не «перескакивая» через промежуточные
звенья. Особенно важно то, что перенос электронов сопряжен с
аллостерическими изменениями определенных белков молекул, в pезультате чего
энергетически выгодный поток электронов вызывает перекачивание протонов
(Н+) через внутреннюю мем6рану из матрикса в межмембранное пространство и
далее за пределы митохондрии. Передвижение протонов приводит к двум важным
следствиям: 1) между двумя сторонами внутренней мембраны создается
градиент рН - в матриксе рН выше, чём в цитозоле, где значение рН обычно
близко к 7,0 (так как малые молекулы свободно проходят через наружную
мембрану митохондрии, рН в межмембранном пространстве будет таким же как в
цитозоле); 2) на внутренней мембране создается градиент напряжения
(мембранный потенциал), причем внутренняя сторона мембраны заряжается
отрицательно, а наружная - положительно. Градиент рН ((рН) заставляет ионы
Н+ переходить обратно в матрикс, а ионы ОН- из матрикса, что усиливает
эффект мембранного потенциала, под действием которого любой положительный
заряд притягивается в матрикс, а любой отрицательный выталкивается из него.
Совместное действие этих двух сил приводит к возникновению
электрохимического протонного градиента. Электорохимический протонный
градиент создает протонодвижущую силу, измеряемую в милливольтах (мВ). Энергия электрохимического протонного градиента используется для
синтеза АТФ и транспорта метаболитов и неорганических ионов в матрикс. Внутренняя мембрана митохондрий отличается необычно высоким
содержанием белка - в ней по весу примерно 70% белка и
30%фосфолипидов. Многие из этих белков входят в состав электронтранспортной
цепи, поддерживающей протонный градиент на мембране. Другой важный
компонент - фермент АТФ-синтетаза, катализирующий синтез АТФ. Это большой
белковый комплекс, через который протоны перетекают обратно в матрикс
по электрохимическому градиенту. Подобно турбине, АТФ-синтетаза
преобразует одну форму энергии в другую, синтезируя АТФ из AДФ и Фн в
митохондриальном матриксе в ходе реакции, сопряжённой с током протонов в
матрикс (см. рисунок 3). Рисунок 3. Общий механизм окислительного фосфорилирования.[1,1994] Но синтез АТФ - это не единственный процесс, идущий за
счет энергии электрохимического градиента. В матриксе, где находятся
ферменты, участвующие в цикле лимонной кислоты и других метаболических
реакциях, необходимо поддерживать высокие концентрации различных
субстратов; в частности, для АТФ-синтетазы требуются AДФ и фосфат. Поэтому
через внутреннюю мембрану должны транспортироваться разнообразные несущие
заряд субстраты. Это достигается с помощью различных белков-переносчиков,
встроенных в мембрану, многие из которых активно перекачивают определенные
молекулы против их электрохимических градиентов, т.е. осуществляют процесс,
требующий затраты энергии. Для большей части метаболитов источником этой
энергии, служит сопряжение с перемещением каких-то других молекул «вниз» по
их электрохимическому градиенту. Например, в транспорте АДФ
участвует система антипорта АДФ-АТФ: при переходе каждой молекулы AДФ в
матрикс из него выходит по своему электрохимическому градиенту одна
молекула АТФ. В то же время система симпорта сопрягает переход фосфата
внутрь митохондрии с направленным туда же потоком Н+: протоны входят в
матрикс по своему градиенту и при этом “тащат” за собой фосфат. Подобны
образом переносится в матрикс и пируват. Энергия электрохимического
протонного градиента используется также для переноса в матрикс ионов Са2+ ,
которые, по-видимому, играют важную роль в регуляции активности некоторых
митохондриальных ферментов. Чем больше энергии электрохимического градиента затрачивается на
перенос молекул и ионов в митохондрию, тем меньше остается для синтеза АТФ.
Например, если изолированные митохондрии поместить в среду с высоким
содержанием Са2 + , то они полностью прекратят синтез АТФ; вся энергия
градиента будет расходоваться на транспорт Ca2+ в матьрикс. В некоторых
специализированных клетках электрохимический протонный градиент
«шунтируется» таким образом, что митохондрии вместо синтеза АТФ образуют
тепло. Очевидно, клетки способны регулировать использование энергии
электрохимического протонного градиента и направлять ее на те процессы,
которые наиболее важны в данный момент. Быстрое превращение АДФ в АТФ в митохондриях позволяет поддерживать
высокое отношение концентраций ATФ/AДФ в клетках. С помощью особого белка,
встроенного во внутреннюю мембрану, AДФ транспортируется в матрикс в обмен
на АТФ по принципу антипорта. В результате молекулы AДФ, высвобождаемые при
гидролизе АТФ в цитозоле, быстро поступают в митохондрию для «перезарядки»,
в то время как молекулы АТФ, образующиеся в матриксе в процессе
окислительного фосфорилирования, тоже быстро выходят в цитозоль, где они
нужны. В организме человека молекулы АТФ за сутки, что позволяет
поддерживать в клетке концентрацию АТФ, более чем в 10 раз превышающую
концентрацию АДФ. В процессе окислительного фосфорилирования каждая пара электронов НАДH
обеспечивает энергией образование примерно трех молекул АТФ. Пара
электронов ФАДH2, обладающая меньшей энергией, дает энергию для синтеза
только двух молекул АТФ. В среднем каждая молекула ацетил-СоА поступающая в
цикл лимонной кислоты, дает около 12 молекул АТФ. Это означает, что
при окислении одной молекулы глюкозы образуются 24 молекулы АТФ, а при окислении одной молекулы пальмитата - жирной кислоты с 16
углеродными атомами - 96 молекул АТФ. Если учесть также экзотермические
реакции, предшествующие образованию ацетил-СоА, окажется, что полное
окисление одной молекулы глюкозы дает около 36 молекул АТФ, тогда как при
полном окислении пальмитата образуется примерно 129 молекул АТФ. Это
максимальные величины, так как фактически количество синтезируемого в
митохондриях АТФ зависит от того, какая доля энергии протонного градиента
идет на синтез АТФ, а не на другие процессы. Если сравнитъ изменение
свободной энергии при сгорании жиров и углеводов прямо до СО2 и Н2О с общим
количеством энергии, запасаемой в фосфатных связях АТРФ в
процессах биологического окисления, окажется, что эффективность
преобразования, энергии окисления в энергию АТФ часто превышает 50%.
Поскольку вся неиспользованная энергия высвобождается в виде тепла, крупные
организмы нуждались бы в более эффективных способах отвода тепла в
окружающую среду. Огромное количество свободной энергии, высвобождаемое при окислении,
может эффективно использоваться только мелкими порциями. В сложном
процессе окисления участвует много промежуточных продуктов, каждый из
которых лишь незначительно отличается от предыдущего. Благодаря этому
высвобождаемая энергия дробится на меньшие количества, которые можно
эффективно преобразовывать с помощью сопряженных реакций в
высокоэнергетические связи молекул АТФ и НАДH . В 1960 г. было впервые показано, что различные мембранные белки,
участвующие в окислительном фосфорилировании, могут быть выделены без
потери активности. От поверхности субмитохондриальных частиц удалось
отделить и перевести в растворимую форму усеивающие их крошечные белковые
структуры. Хотя субмитохондриальные частицы без этих сферических структур
продолжали окислять НАДH в присутствии кислорода, синтеза АТФ при этом не
происходило. С другой стороны, выделенные структуры действовали как
АТФазы, гидролизуя АТФ до АДФ и Фн. Когда сферические структуры
(названные F1-АТФазами) добавляли к лишенным их субмитохондриальным
частицам, реконструированные частицы вновь синтезировали АТФ из AДФ и Фн.
F1- АТФаза - это часть большого, пронизывающего всю толщу мембраны
комплекса, который состоит по меньшей мере из девяти различных
полипептидных цепей. Этот комплекс получил название АТФ-синтетаза; он
составляет около 15% всего белка внутренне митохондриальнои мембраны.
Весьма сходные АТФ-синтетазы имеются в мембранах хлоропластов и бактерий.
Такой белковый комплекс содержит трансмембранные каналы для
протонов, и происходит только тогда, когда через эти каналы проходят
протоны вниз по своему электрохимическому градиенту. АТФ-синтетаза может действовать в обратном направлении - расщеплять
АТФ и перекачивать протоны. Действие АТФ-синтетазы обратимо: онa способна
использовать как энергию гидролиза АТФ для перекачивания протонов через
внутреннюю митохондриальную мембрану, так и энергию потока протонов по
электрохимическому градиенту для синтеза АТФ. Таким образом, АТФ-синтетаза
- это обратимая сопрягающая система, которая осуществляет взаимопревращение
энергии электрохимического протонного градиента и химических связей.
Направление ее работы зависит от соотношения между крутизной протонного
градиента и локальной величиной (G для гидролиза АТФ. АТФ-синтетаза получила свое название в связи с тем, что в обычных
условиях npoтоннoro градиента, поддерживаемого дыхательной цепью,
синтезирует большую часть всего АТФ клетки. Число протонов, необходимое для
синтеза одной молекулы АТФ, в точности не известно. При прохождении
через АТФ-синтетазу протонов синтезируется одна молекула АТФ. Как будет работать в данный момент АТФ-синтетаза - в направлении
синтеза или гидролиза АТФ, - зависит от точного баланса между изменениями
свободной энергии для прохождения трех протонов через мембрану в матрикc и
для синтеза АТФ в матриксе. Как уже говорилось, величина (Gсинт.АТФ
определяется концентрациями трех веществ в матриксе митохондрии - АТФ, AДФ
и Фн. При постоянной протонодвижущей силе АТФ-синтетаза будет синтезировать
ATФ тех пор, пока отношение АТФ к AДФ и Фн не достигнет такого значения,
при котором величина (Gсинт.АТФ станет в точности равна +15,2ккaл/мoль. При
таких условиях синтез АТФ будет точно уравновешиваться его гидролизом. Предположим, что в связи с реакциями, требующими затраты энергии, в
цитозоле внезапно гидролизовалось большое количество АТФ, и это привело к
падению отношения АТФ:AДФ в матриксе митохондрии. В этом случае (Gсинт.
понизится и АТФ-синтетаза вновь переключится на синтез АТФ, пока не
восстановится исходное отношение АТФ:AДФ. Если же протонодвижущая сила
внезапно снизится и будет поддерживаться на постоянном уровне, то АТФ-
синтетаза начнет расщеплять АТФ, и эта реакция будет продолжаться до тех
пор, пока соотношение между концентрациями ATФ и AДФ не достигнет какого-то
нового значения (при котором (Gсинт.АТФ = +13,8 ккал/моль), и так далее. Если АТФ-синтетаза в норме не транспортирует Н+ из матрикса, то
дыхательная цепь, находящаяся во внутренней митохондриальной мембране, при
нормальных условиях переносит через эту мембрану протоны, создавая таким
образом электрохимический протонный градиент, доставляющий энергию, для
синтеза AТФ. Большинство переносчиков электронов, входящих в состав дыхательной
цепи, поглощают свет, и их окисление или восстановление сопровождается
изменением цвета. Обычно спектр поглощения и реакционноспособность каждого
переносчика достаточно характерны, что позволяет даже в неочищенном
экстракте прослеживать изменения его состояний с помощью спектроскопии. Это
дало возможность выделить такие переносчики задолго до того, как стала
понятна их истинная функция. Например, цитохромы были открыты в 1925 г. как
соединения, которые быстро окисляются и восстанавливаются у таких различных
организмов, как дрожжи, бактерии и насекомые. Наблюдая клетки и ткани с
помощью спектроскопа, удалось идентифицировать три типа цитохромов, которые
различались по спектрам поглощения и названы цитохромами а, b и c. Клетки
содержат несколько видов цитохромов каждого типа, и классификация по
типам не отражает их функцию. Самый простой переносчик электронов представляет собой небольшую
гидрофобную молекулу, растворенную в липидном бислое и называемую
убихиноном или коферментом Q. Он способен принять или отдать как один, так
и два электрона и временно захватывает из среды протон при переносе каждого
электрона. Рисунок 4. Структура убихинона.[10,1993] Дыхательная цепь содержит три больших ферментных комплекса, встроенных
во внутреннюю мембрану Мембранные белки трудно выделить в виде интактных комплексов,так как
они нерастворимы в большинстве водных растворов, а такие вещества, как
детергенты и мочевина, необходимые для их солюбилизации, могут нарушать
нормальное белок-белковое взаимодействие. Однако в начале 1960-х гг. было
обнаружено, что с помощью относительно мягких ионных детергентов, таких как
дезоксихолат, можно солюбилизировать некоторые компоненты митохондриальной
внутренней мембраны в нативной форме. Это позволило идентифицировать и
выделить три главных связанных с мембраной комплекса дыхательных ферментов
на пути от НАДH до кислорода. Рисунок 5. Дыхательные ферментные комплексы.[1,1994] 1. НАДН-дегидрогеназный комплекс - самый большой из дыхательных
ферментных комплексов - имеет молекулярную массу свыше 800000 и
содержит более 22 полипептидных цепей. Он принимает электроны от НАДH и
передает их через флавин и по меньшей мере пять железо-серных центров на_
убихинон - небольшую жирорастворимую молекулу, передаюшую электроны на
второй комплекс дыхательных ферментов-комплекс b-c1. 2. Комплекс b-с1 состоит по меньшей мере из 8 разных полипептидных
цепей и, вероятно, существует в виде димера с молекулярной массой 500000.
Каждый мономер содержит три тема, связанных с цитохромами, и железо-серный
белок. Комплекс принимает электроны от убихинона и передает цитохрому с,
небольшому периферическому мембранному белку, который затем переносит их на цитохром-оксидазный комплекс.
3.Цитохромоксидазный комплекс (цитохром аа3) - наиболее изученный из трех
комплексов. Он состоит не менее чем из восьми различных полипептидных цепей
и выделен как димерс молекулярной массой 300000; каждый мономер содержит
два цитохрома и два атома меди.этот комплекс принимает электроны от
цитохрома с и передает их на кислород. Цитохромы, железо-серные центры и атомы меди способны переносит
одновременно только один электрон. Между тем, каждая молекула НАДН отдает
два электрона и каждая молекула О2 должна принять 4 электрона при
образовании молекулы воды. В электронтранспортной цепи имеется несколько
электронсобирающих и электронраспределяющих участков, где согласовывается
разница в числе электронов. Так, например, цитохромоксидазный комплекс
принимает от молекул цитохрома с по отдельности 4 электрона и в конечном
итоге передает их на одну связанную молекулу О2, что ведет к образованию
двух молекул воды. На промежуточных ступенях этого процесса два электрона,
прежде чем перейти к участку, связывающему кислород, поступают в гем
цитохрома а, и связанный с белком атом меди, Cua. В свою очередь участок
связывания кислорода содержит еще один атом меди и гем цитохрома а3. Однако
механизм образования двух молекул воды в результате взаимодействия
связанной молекулы О2 с четырьмя протонами в точности не известен. В большинстве клеток с цитохромоксидазой взаимодействует около 90%
всего поглощаемого кислорода. Токсичность таких ядов, как цианид и азид,
связаны с их способностью прочно присоединяться к цитохромоксидазному
комплексу и блокировать тем самым весь транспорт электронов. Два компонента, переносящие электроны между тремя главными ферментными
комплексами дыхательной цепи, - убихинон и цитохром с – быстро перемещаются
путем диффузии в плоскости мембран. Столкновения между этими подвижными переносчиками и ферментными
комплексами вполне позволяют объяснить наблюдаемую скорость переноса
электронов (каждый комплекс отдает и принимает один электрон каждые 5-10
миллисекунд). Поэтому нет необходимости предполагать структурную
упорядоченность цепи белков-переносчиков в липидном бислое; в самом деле,
ферментные комплексы, видимо существуют в мембране как независимые
компоненты и упорядоченный перенос электронов обеспечивается только
специфичностью функциональных взаимодействий между компонентами цепи. В пользу этого говорит и тот факт, что различные компоненты дыхательной
цепи присутствуют в совершенно разных количествах. Например, в
митохондриях сердца на каждую молекулу НАДН-дегидрогеназного комплекса
приходятся З молекулы | комплекса b-c1 комплекса, 7 молекул
цитохромоксидазного комплекса, 9 молекул цитохрома с и 50 молекул
убихинона; весьма различные соотношения этих белков обнаружены и в
некоторых других клетках. Значительный перепад окислительно-восстановительного потенциала на
каждом из трех комплексов дыхательной цепи доставляет энергию, необходимую
для перекачивания протонов. Такую пару, как Н2О и ЅО2 (или НАДH и НАД+), называют сопряженной
окислительно-восстановительной парой, так как один из ее членов
превращается в другой, если добавить один или несколько электронов и один
или несколько протонов (последних всегда достаточно в любом водном
растворе). Так, например, ЅО2 + 2е + 2Н+ ( Н2О Хорошо известно, что смесь соединений, образующих сопряженную кислотно-
щелочную пару, в соотношении 50:50 действует как буфер, поддерживающий
определенное «давление протонов» (рН), величина которого определяется
константой диссоциации кислоты. Точно таким же образом смесь компонентов
пары в соотношении 50:50 поддерживает определенное «давление
электронов», или окислительно-восстановительный потенциал (редокс-
потенциал) Е, служащий мерой сродства молекулы-переносчика к электронам. Помещая электроды в раствор с соответствующими окислительно-
восстановительными парами, можно измерить редокс-потенциал каж-дого
переносчика электронов, участвующего в биологических окислительно-
восстановительных реакциях. Пары соединений с наиболее отрицательными
значениями редокс-потенциала обладают наименьшим сродством к электронам,
т.е. coдepжaт перенocчики с наименьшей тенденцией принимать электроны и
наибольшей тенденцией их отдавать. Например, смесь НАДH и НАД+ (50:50)
имеет редокс-потенциал -320 мВ, что указывает на сильно выраженную
способность НАДH отдавать электроны, тогда как редокс-потенциал смеси
равных количеств Н2О и ЅО2 составляет +820 мВ, что означает сильную
тенденцию 02 к принятию электронов. Резкий перепад имеет место в пределах каждого из трех главных
дыхательных комлексов. Разность потенциалов между любыми_двумя
переносчиками электронов прямо пропорциональна энергии, высвобождаемой при переходе электрона от одного переносчика к другому. Каждый комплекс
действует как энергопреобразующее устройство, направляя эту свободную
энергию на перемещение протонов через мембрану, что приводит к созданию
электрохимического протонного градиента по мере прохождения электронов по
цепи.
Страницы: 1, 2, 3, 4
|
|